(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210063028.4 (22)申请日 2022.01.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114085903 A (43)申请公布日 2022.02.25 (73)专利权人 广州嘉检医学检测有限公司 地址 510000 广东省广州市广州国际生物 岛螺旋四路9号第二层C201单 元 (72)发明人 张巍　 (74)专利代理 机构 华进联合专利商标代理有限 公司 44224 代理人 林青中 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 WO 202023 0601 A1,2020.1 1.19 CN 1806052 A,2006.07.19 CN 10819 2965 A,2018.0 6.22 CN 112111568 A,2020.12.2 2 CN 103451268 A,2013.12.18 CN 113322317 A,2021.08.31 Chang Ho Ahn 等.Ef fects of MOTS ‑c on the mitoc hondrial functi on of cel ls harboring 3243 A to G mutant mitochondrial DNA. 《Mo lecular Bi ology Reports》 .2020,第47 卷第4029-4035页. 林晓贞 等.应用实时荧 光定量聚合酶链反 应结合突变阻滞形成系统进行线粒体脱氧核糖 核酸A3243 G突变负荷检测. 《中华神经 科杂志》 .2009,第42卷(第3期),第197-20 0页. Wang Jing 等.Analysis of Mitochondrial DNA Po int Mutati on Heteroplas my by ARMS Quantitative PCR. 《Current Protoco ls in Human Genetics》 .2011,第1-16页. T. Nomiyama 等.Ac cumulati on of somatic mutati on in mitochondrial DNA extracted from peripheral bl ood cells in diabetic patients. 《Diabeto logia》 .20 02,第 45卷第157 7-1583页. Ren-Kui Bai 等.Detecti on and Quantificati on of Heteroplas mic Mutant Mitochondrial DNA by Real-Time Amplification Refractory Mutati on System Quantitative PCR Analysis: A Si ngle-Step Approach. 《Clinical Chemistry》 .20 04,第50卷 (第6期),第9 96-1001页. 审查员 于淼 (54)发明名称 检测线粒体3243A＞G突变的引物对探针组 合产品及其试剂盒与检测方法 (57)摘要 本发明涉及基因技术领域， 具体而言， 涉及 一种检测线粒体3243A＞G突变的引物对探针组 合产品及其试剂盒与检测方法。 本发明使用ARMS 结合荧光PCR技术具有高特异性以及高灵敏性， 检测时耗短、 成本低， 结果 直观好判读。 权利要求书1页 说明书35页 序列表2页 附图1页 CN 114085903 B 2022.04.26 CN 114085903 B 1.引物对探针组合产品， 其特征在于， 所述引物对包括： 选自核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1~ SEQ ID NO： 3至少一种所示的上游引物， 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示的下游引物； 所述探针包括SEQ  ID NO： 5所示的检测探针； 所述引物对还包括内参引物对， 所述探针还包括内参探针； 所述内参引物对和所述内 参探针用于定量检测线粒体保守区域的核酸片段的表达； 所述内参引物对的上游引物、 下 游引物的核苷 酸序列依次如SEQ  ID NO： 6和SEQ  ID NO： 7所示， 所述内参探针的核苷 酸序列 如SEQ ID NO： 8所示。 2.根据权利要求1所述的组合产品， 其特征在于， 所述探针为自身淬灭探针， 且所述内 参探针与所述检测探针的荧 光发射基团信号可区分。 3.含有权利要求1~2任一项所述的组合产品的试剂盒。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其还包含扩增缓冲液、 dNTP、 Mg2+、 UNG 酶、 DNA聚合酶、 阳性质控品、 阴性质控品、 防腐剂以及水中的至少一种。 5.权利要求1~2任一项所述的组合产品在制备线粒体病检测试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114085903 B 2检测线粒体3243A＞G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒 与检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基因技术领域， 具体而言， 涉及一种检测线粒体3243A＞G突变的引物 对探针组合产品及其试剂盒与检测方法。 背景技术 [0002]线粒体是真核细胞中重要的细胞器， 是为细胞提供能量的场所， 其氧化代谢为机 体提供了80%以上的能量。 线粒体  DNA （mitochondrial  DNA, mtDNA） 是细胞核染色体外的 基因组， 具有自我复制、 转录和编码功能， 是一套相对独立的遗传控制系统， 但同时又受到 核DNA 的控制。 人类的mtDNA分子是一个长  16569bp 的双链闭环超螺旋  DNA分子， 包括一 条轻链 （L链） 和一条重链 （H链） ， IL、 IH1和IH2分别是L链和H链的转录起始点， 包含有  13 个 多肽编码基因， 22个tRNA基因和  2个rRNA 基因。 这些基因呈紧密排列， 任何随机性突变都 将诱导编码 DNA 序列过程， 造成线粒体功能的异常。 [0003]线粒体病是指由于mtD NA或核 DNA缺陷引起线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍为 特点的一组遗传性疾病， 不包括其他因素导致的继发性线粒体功能障碍性疾病。 目前已发 现近 200 种不同的人类  mtDNA 突变。 A3243G  突变是mtDNA  上最常见的致病突变。 m.3243A>G  突变位于  tRNALeu(UUR)基因的双氢尿嘧啶环中， 此处是  16S rRNA 和t  RNALeu(UUR)基因之间的交界处， 是促进转录终止的蛋白质因子结合部位。 因而， 该位点发 生基因突变将导致转录终止因子结合障碍， 线粒体氧化磷酸化蛋白合成缺陷， ATP  生成不 足。 [0004]m.3243A>G 突变患者可表现为综合征或非综合征线粒体疾病， 也可以是无症状患 者。 m.3243A>G  突变最常见的综合征表现是线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合 征 （mitochondria  encephalomyopathy  with lactic acidosis  and stroke‑like  episodes， MELAS） ， 随后研究发现更多与  m.3243A>G  突变相关的临床表型， 包括母系遗传 糖尿病伴耳聋 （(maternally inherited di abetes and deafness,  MIDD） 、 以肢带型无力 为主要症状的线粒体肌病， 以及 肠梗阻、 胰腺炎等非 典型 MELAS综合征。 [0005]单个核苷酸的变异， 包括置换、 颠换、 缺失和插入等， 常用的分析方法有PCR ‑测序 法、 Sanger测序法、 高通量测序技术、 PCR ‑芯片杂交法、 突变扩增系统(amplification   refractory  mutation  system, ARMS)等。 这些传统技术中， 直接测序的方法时间周期较 长， 不能及时为医生 提供指导； 芯片法成本高， 使应用受到一定限制。 [0006]有鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0007]本发明的第一方面涉及一种引 物对探针组合产品， 所述引 物对包括： 选自核苷酸 序列如SEQ  ID NO： 1~ SEQ ID NO： 3至少一种所示的上游引物， 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4 所示的下游引物；说　明　书 1/35 页 3 CN 114085903 B 3