(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210063595.X (22)申请日 2022.01.20 (71)申请人 新疆农业大 学 地址 830052 新疆维吾尔自治区乌鲁 木齐 市沙依巴克区八一街道农大东路311 号 申请人 华南农业大 学 (72)发明人 袁浩　袁子国　张锡锐　张秀香　 杨子鹏　闫紫荆　王艳云　张翩　 任照文　宋伊宁　 (74)专利代理 机构 广州独角熊知识产权代理事 务所(特殊普通 合伙) 44580 专利代理师 张小黎 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01)C12N 15/11(2006.01) G16B 20/00(2019.01) G16B 30/10(2019.01) G16B 50/30(2019.01) (54)发明名称 弓形虫感染动物宿主脑组织差异表达基因 的筛选方法及其应用 (57)摘要 本发明提供弓形虫感染动物宿主脑组织差 异表达基因的筛选方法及其应用， 通过利用应用 转录组测序技术配合生物信息学分析弓形虫感 染前动物宿主脑组织的基因表达差异情况， 筛选 鉴定弓形虫感染动物宿主后脑组织的差异表达 基因。 该方法能快速有效地进行基因表达差异的 研究， 为揭示动物宿主感染弓形虫后的机体免疫 应答提供参考， 采用qRT ‑PCR方法对其中的10个 差异表达基因CCL5、 CCL8、 CCL23、 CASP8、 TLR1、 TLR4、 STAT1、 ROS1、 NOS1、 NOS2进行了验证， 将筛 选到的差异表达基因作为诊断宿主弓形虫脑部 感染的靶 标基因， 有利于包括果子狸及其他野生 动物在内的动物宿主脑部弓形虫感染的准确判 别， 为野生动物弓形虫感染的诊断提供诊断靶 标。 权利要求书2页 说明书11页 序列表4页 附图4页 CN 114507726 A 2022.05.17 CN 114507726 A 1.一种弓形 虫感染动物宿主脑组织差异 表达基因的筛 选方法， 其包 含以下步骤： 1)提取动物宿主脑组织RNA， 构建文库并进行转录组测序； 2)对测序原始数据进行过滤， 去除带接头的、 ploy ‑N和测序引物的低质量reads， 同时 计算Q20、 Q30、 GC含量和clean  reads的序列重复性， 获得高质量clean  reads； 3)使用Trinity程序对clean  reads进行拼接， 获取转录本序列， 取每条基因中最长的 转录本作为Un igene； 4)将clean  reads比对到数据库SW ISS‑PROT、 NR、 KEG G、 KOG和Pfam进行基因功能注释； 5)用DEGseq程序中的MARS模型计算每个基因的FPKM值评估基因表达水平， FPKM值大于 1000的为高表达基因， 设置P<0.05， | log2(fold  change)|≧1， FDR校正的q值<0.05， 满足条 件的差异显著阈值标为sign ificant， 筛 选显著差异 表达基因； 6)设置显著性筛选 的标准： P<0.05， 通过GO数据库对显著差异表达基因进行基因功能 性分类； 7)设置显著性筛选 的标准： P<0.05， 通过KEGG数据库对显著差异表达基因进行通路分 析。 2.用于检测弓形虫感染的靶标位点， 其特征在于， 所述靶标位点为弓形虫感染宿主后 脑组织的差异 表达基因， 包括： 1)转录上调基因C CL5、 CCL8、 CCL23、 CAS P8、 TLR1、 TLR4中的一种或多种； 和/或 2)转录下调基因STAT1、 ROS1、 NOS1、 NOS2中的一种或多种。 3.用于检测弓形虫感染的引物， 其特征在于， 所述引物针对如权利要求2所述的靶标位 点设计， 包括以下1) ‑10)所述引物组的一种或多种： 1)如SEQ ID NO.1‑2所示针对C CL5的引物组； 2)如SEQ ID NO.3‑4所示针对C CL8的引物组； 3)如SEQ ID NO.5‑6所示针对C CL23的引物组； 4)如SEQ ID NO.7‑8所示针对CAS P8的引物组； 5)如SEQ ID NO.9‑10所示针对TLR 1的引物组； 6)如SEQ ID NO.11‑12所示针对TLR4的引物组； 7)如SEQ ID NO.13‑14所示针对STAT1的引物组； 8)如SEQ ID NO.15‑16所示针对ROS1的引物组； 9)如SEQ ID NO.17‑18所示针对NOS1的引物组； 10)如SEQ  ID NO.19‑20所示针对NOS2的引物组。 4.用于检测弓形 虫感染的试剂盒， 其特 征在于， 包括如权利要求3所述的引物。 5.用于检测弓形虫感染的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法以权利要求2所述的弓 形虫感染宿主后脑组织的差异 表达基因为检测对象； 当CCL5、 CCL8、 CCL23、 CASP8、 TLR1、 TLR4中的一种或多种基因转录上调， 和 /或STA T1、 ROS1、 NOS1、 NOS2中的一种或多种基因转录下调时， 判断宿主脑部感染弓形 虫。 6.如权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法利用 如权利要求3所述的 引物对宿主脑组织进行检测。 7.如权利要求1所述的弓形虫感染动物宿主脑组织差异表达基因的筛选方法、 如权利权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114507726 A 2要求2所述的用于检测弓形虫感染的靶标位点、 如权利要求3所述的用于检测弓形虫感染的 引物、 如权利要求4所述的用于检测弓形虫感染的试剂盒或如权利要求5所述的用于检测弓 形虫感染的检测方法在制备弓形虫感染关联信号通路生物标志物或诊断试剂中的应用， 其 中， 所述信号通路包括但 不限于Jak‑STAT信号通路、 趋化因子信号通路、 Toll样受体信号通 路。 8.如权利要求1所述的弓形虫感染动物宿主脑组织差异表达基因的筛选方法、 如权利 要求2所述的用于检测弓形虫感染的靶标位点、 如权利要求3所述的用于检测弓形虫感染的 引物、 如权利要求4所述的用于检测弓形虫感染的试剂盒或如权利要求5所述的用于检测弓 形虫感染的检测方法在制备弓形虫感染关联疾病生物标志物、 诊断试剂或靶向药物中的应 用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114507726 A 3