(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210066886.4 (22)申请日 2022.01.20 (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号中山大 学化学学院 (72)发明人 戴宗　梁玉玲　柳思扬　邹小勇　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 林德强 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6834(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) B82Y 5/00(2011.01)B82Y 40/00(2011.01) C09K 11/06(2006.01) C09K 11/02(2006.01) B01J 13/02(2006.01) (54)发明名称 一种用于活细胞miRNA连续成像监测的荧光 探针 (57)摘要 本发明公开了一种用于活细胞miRNA连续成 像监测的荧光探针， 通过选取对癌细胞具有较强 生物相容性的Au NPs材料， 在Au NPs表面原位聚合 生成一层聚多巴胺， 形 成AuNPs@PDA核壳结构。 由 于AuNPs@PDA对发夹探针的高效负载及保护作 用， 发夹探针可以在细胞质中保持稳定并且持续 被释放， 从而起到连续监测成像的目标。 本发明 中的探针在0.51nM ‑100nM之间有较好的线性关 系， 检出限为0.51nM； 而且探针 水解率低， 可 实现 48小时内长时间胞内检测。 这一简便快速且可以 对药物作用后的活细胞miRNA进行长时间监测的 方法， 在特异性细胞类型的鉴定、 药物筛选、 以及 精准医疗方面具有巨大潜力。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图9页 CN 114480646 A 2022.05.13 CN 114480646 A 1.一种探针， 所述探针的核苷酸序列如下所示： CCGGGTAACTATACAACCTACTACCTCAACCC GG。 2.根据权利要求1所述的探针， 其特征在于， 所述探针的5'端标记荧光基团； 优选地， 所 述探针3'端标记荧光淬灭基团； 优选地， 所述的荧光基团选自FAM、 VIC、 ROX、 CY5、 TET、 JOE、 TAMRA、 HEX或CY3； 所述的淬灭基团为BHQ1、 BHQ2、 TAMRA、 E CLIPSE或DABC YL。 3.一种检测体系， 包括权利要求1～ 2任一项所述的探针。 4.一种纳米粒子复合物， 包含权利要求1～2任一项所述的探针或权利要求3任一项所 述检测体系。 5.根据权利要求4所述的纳米粒子复合物， 其特征在于， 所述纳米粒子复合物中还包含 金纳米粒子； 优选地， 所述金纳米粒子为聚多巴胺包裹的金纳米粒子 。 6.权利要求1～2任一项所述的探针或权利要求3所述检测体系或权利要求4～5任一项 所述的复合物在检测生物靶标中的应用； 优选为在活细胞中检测生物靶标； 更优选地， 所述 活细胞为癌细胞。 7.一种生物靶标的检测方法， 包括使用权利要求1～2任一项所述的探针或权利要求3 所述检测体系或权利要求 4～5任一项所述的复合物。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 还包括给药后实现对生物靶标的实时 监测。 9.权利要求5所述纳米粒子复合物的制备 方法， 包含以下步骤： S1： 金纳米粒子的合成； S2： 多巴胺在金纳米粒子表面聚合形成聚多巴胺包裹金纳米粒子； S3： AuNPs@P DA负载权利要求1～ 2任一项所述探针。 10.根据权利要求9所述的制备方法， 其特征在于， 所述多巴胺的聚合浓度为0.05～ 0.1g/L； 优选地， 所述AuNPs@P DA的浓度为0.1～0.3nM 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480646 A 2一种用于活细胞miRNA连续成像监测的荧光探针 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种用于活细胞miRNA连续成像监测的 荧光探针。 背景技术 [0002]成熟的microRNA(miRNA)是一类进化保守、 单链、 长度约19～23个碱基、 内源性表 达和非蛋白编码的RNA， 广泛参与动物、 植物和病毒的后转录过程， 调控基因的表达。 大量研 究表明miRNAs参与细胞分化、 增殖、 凋亡和细胞因子的产生， 特异性miRNA的异常表达与不 同癌症的发生发展密切相关。 miRNA能够调节致癌基因与肿 瘤抑制途径， miRNA表达水平的 高低与肿瘤的恶化程度和种类息息相关， 这意味着miRNA可作为癌症标志物和用于基因治 疗以及作为潜在的药物靶点。 有许多抗癌药物是通过引起肿瘤中mi RNA表达水平改变， 从而 产生抗癌抗肿瘤 效果。 其中， 二甲双胍通过预防侵袭性乳腺癌的分子功能实现调节肿瘤细 胞内let‑7a表达上调， 降低肿瘤细胞的自我复制能力和抑制肿瘤干细胞向乳腺癌细胞分 化， 从而达到治疗癌症的效果。 可见， 通过对 药物作用后的mi RNA表达量进 行实时监测， 可以 实时确定药物作用的时空分布， 有助于精准医疗。 [0003]但是常见的活细胞miRNA成像方法， 例如分子信标和HCR方法， 通常无法实现对 miRNA水平的连续监测。 原因如下： 1)分子信 标和HCR所用发夹探针容易在细胞内环境中被 胞质核酸外切酶分解。 2)HCR等扩增反应所需核酸探针量较大且需时较长， 较难在生物友好 的条件下实现大量的核酸转运， 因而较难以实现基于扩增方法的长时间miRNA监测。 3)分子 信标虽然响应迅速且所需探针量较少， 但是常见脂质体转染或纳米颗粒转运会导致探针在 细胞环境中迅速释放， 从而也无法实现长时间miRNA监测。 发明内容 [0004]本发明的第一个目的在于， 提供一种探针。 [0005]本发明的第二个目的在于， 提供一种检测体系。 [0006]本发明的第三个目的在于， 提供一种纳米粒子复合物。 [0007]本发明的第四个目的在于， 提供一种生物靶标的检测方法。 [0008]本发明的第五个目的在于， 提供 上述纳米粒子复合物的制备 方法。 [0009]本发明所采取的技 术方案是： [0010]本发明的第一方面， 提供一种探针， 所述探针的核苷酸序列如下所示： CCGGGTAAC TATACAACCTACTACCTCAACCCGG。 [0011]在本发明的一些实施方式 中， 所述探针的5'端标记荧 光基团。 [0012]在本发明的一些优选实施方式 中， 所述探针3'端标记荧 光淬灭基团。 [0013]在本发明的一些实施方式中， 所述荧光基团选自FAM、 VIC、 ROX、 CY5、 TET、 JOE、 TAMRA、 HEX或CY3； 所述淬灭基团为BHQ1、 BHQ2、 TAMRA、 E CLIPSE或DABC YL。 [0014]本发明的第二方面， 提供一种检测体系， 包括本发明第一方面所述的探针。说　明　书 1/7 页 3 CN 114480646 A 3