(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210062388.2 (22)申请日 2022.01.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114085929 A (43)申请公布日 2022.02.25 (73)专利权人 济凡生物科技 （北京） 有限公司 地址 102299 北京市昌平区科技园区双营 西路79号院3 3号楼4层402室 (72)发明人 牟新涛　刘婉君　韩典霖　杨亮　 龚小鹏　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 张立娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 111074000 A,2020.04.28CN 113584226 A,2021.1 1.02 CN 110878377 A,2020.0 3.13 CN 110551853 A,2019.12.10 CN 110885905 A,2020.0 3.17 万方.非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴 别检测规范. 《四川畜牧兽医》 .2021,第48卷(第6 期),第34- 35页. YanxingLin等.Devel opment of a triplex real-time PCR as say for detecti on and differentiati on of gene-deleted and w ild- type African sw ine fever virus. 《Journal of Virological Methods》 .2020,第280卷 113875. Zhenhua Guo 等.Devel opment and evaluati on of duplex TaqMan real-time PCR assay for detecti on and dif ferentiati on of wide-type and MGF5 05-2R gene-deleted African sw ine fever viruses. 《BM C Veterinary Researc h》 .2020,第16卷428. 审查员 田原 (54)发明名称 一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗 株的试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒 野毒株和疫苗株的试剂盒。 本发 明提供了用于检 测ASFV野毒株和/或疫 苗株的单链DNA组， 由引物 对1 （SEQ ID No.1和SEQ  ID No.2） 和探针1 （SEQ   ID No.3） 、 引物对2 （SEQ  ID No.4和SEQ  ID  No.5） 和探针2 （SEQ  ID No.6） 、 引物对3 （SEQ  ID  No.7和SEQ  ID No.8） 和探针3 （SEQ  ID No.9） 组 成。 本发明建立的多重荧光定量PCR法可有效区 分ASFV野毒感染和基因缺失的疫 苗毒株， 该方法 具良好特异性、 敏感性和重复性， 为ASFV野毒和 疫苗毒的鉴别诊断提供了技术支撑； 具良好的社 会应用前 景。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114085929 B 2022.04.08 CN 114085929 B 1.用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株的单链DNA组， 由如下组成： （A1） 引物对1和探针1； 所述引物对 1为由SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2所示两条单链DNA组成； 所述探针1为SEQ   ID No.3所示单链DNA； （A2） 引物对2和探针2； 所述引物对2为由SEQ  ID No.4和SEQ  ID No.5所示两条单链DNA组成； 所述探针2为SEQ   ID No.6所示单链DNA； （A3） 引物对3和探针3； 所述引物对3为由SEQ  ID No.7和SEQ  ID No.8所示两条单链DNA组成； 所述探针3为SEQ   ID No.9所示单链DNA。 2.根据权利要求1所述的单链DNA组， 其特征在于： 所述探针1、 所述探针2和所述探针3 的两端均分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团， 且所述探针1、 所述探针2和所述探针3 所标记的荧 光报告基团均不同。 3.根据权利 要求1或2所述的单链DNA组， 其特征在于： 在所述单链DNA组中， 所述引物对 1的上游引物、 所述引物对1的下游引物、 所述探针1、 所述引物对2的上游引物、 所述引物对2 的下游引物、 所述探针2、 所述引物对3的上游引物、 所述引物对3的下游引物、 所述探针3的 摩尔比为2:2:1:2:2:1:2:2:1。 4.一种用于检测非洲 猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株的PCR试剂， 其特征在于： 所述PCR试 剂中含有权利要求1 ‑3中任一所述单链DNA组。 5.根据权利 要求4所述的PCR试剂， 其特征在于： 在所述PCR试剂中， 所述引物对1的上游 引物、 所述引物对1的下游引物、 所述引物对2的上游引物、 所述引物对2的下游引物、 所述引 物对3的上游引物、 所述引物对3的下游引物的终浓度均为0.4  pmol/ μL； 所述探针1、 所述探 针2和所述探针3的终浓度均为0.2  pmol/ μL。 6.一种用于检测非洲猪瘟病 毒野毒株和/或疫苗株的试剂 盒， 含有权利要求1 ‑3中任一 所述单链DNA组或权利要求 4或5所述的PCR试剂。 7.如下任一应用： P1、 权利要求1 ‑3中任一所述单链DNA组或权利要求4或5所述的PCR试剂在制 备用于鉴 定或辅助鉴定非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株的产品中的应用； P2、 权利要求1 ‑3中任一所述单链DNA组或权利要求4或5所述的PCR试剂在制 备用于检 测或辅助检测待测非洲猪瘟病毒为野毒株还是疫苗株的产品中的应用； P3、 权利要求1 ‑3中任一所述单链DNA组或权利要求4或5所述的PCR试剂在制 备用于检 测或辅助检测待测病毒是否为非洲猪瘟病毒的产品中的应用； P4、 权利要求1 ‑3中任一所述单链DNA组或权利要求4或5所述的PCR试剂在制 备用于检 测或辅助检测待测样本中是否含有非洲猪瘟病毒的产品中的应用； 所述疫苗株为MGF3 60‑505R和/或CD2 V基因缺失株。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： 所述待测样本选自如下任一： 离体全血、 血 清、 血浆、 淋巴结、 脾脏、 肾脏、 扁桃体、 肌肉、 肉骨粉、 血粉。 9.一种非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定非洲猪瘟病毒野毒株和/或疫苗株的方法， 包括如下步骤： 从待测样 本中提取DNA作为模板， 用权利要求 1‑3中任一所述单链DNA组或权权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114085929 B 2利要求4或5所述的PCR试剂或权利要求6所述试剂盒进行三重荧光定量PCR， 然后根据各通 道的Ct值和扩增曲线 进行结果判定： 若所述探针1对应通道、 所述探针2对应通道、 所述探针3对应通道均满足阳性判定条 件， 则所述待测样品中含有非洲猪瘟病毒， 且为或候选为野毒株； 若所述探针1对应通道满足阳性判定条件， 且所述探针2对应通道和所述探针3对应通 道均不满足阳性判定条件， 则所述待测样品中含有非洲猪瘟病毒， 且为或候选为CD2V与 MGF360‑505R基因联合 缺失株； 若所述探针1对应通道和所述探针2对应通道均满足阳性判定条件， 且所述探针3对应 通道不满足阳性判定条件， 则所述待测样品中含有非洲猪瘟病毒， 且为或候选为MGF360 ‑ 505R基因缺失株； 若所述探针1对应通道和所述探针3对应通道均满足阳性判定条件， 且所述探针2对应 通道不满足阳性判定条件， 则所述待测样品中含有非洲猪瘟病毒， 且为或候选为CD2V基因 缺失株； 若所述探针1对应通道不满足阳性判定条件， 则所述待测样本中不含有或候选不含有 非洲猪瘟病毒； 所述探针1对应通道、 所述探针2对应通道、 所述探针3对应通道的所述阳性判定条件均 为如下a1） 或a2） ： a1） Ct值≤ 35； a2） 35＜Ct值≤ 37且扩增曲线为S型。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于： 进行所述三重荧光定量PCR时， 所述引物 对1的上游引物、 所述引物对1的下游引物、 所述探针1、 所述引物对2的上游引物、 所述引物 对2的下游引物、 所述探针2、 所述引物对3的上游引物、 所述引物对3的下游引物、 所述探针3 的摩尔比为2:2:1:2:2:1:2:2:1； 进行所述三重荧光定量PCR时， 退火温度为6 0℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114085929 B 3