(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210062950.1 (22)申请日 2022.01.20 (71)申请人 元码基因科技 （北京） 股份有限公司 地址 100102 北京市朝阳区广顺北 大街5号 融创动力产业园A栋4层 (72)发明人 孙雪　赵颖　王伟伟　杨洲　 张吉娜　田埂　 (74)专利代理 机构 北京北汇律师事务所 1 1711 代理人 李英杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探 针组、 系统、 检测方法及其应用 (57)摘要 本发明公开用 于二代测序微卫星不稳定位 点检测的探针组、 系统、 检测方法及其应用， 该方 法包括： 选择至少一个微卫星位点作为靶标； 设 计针对靶 标的探针组， 该探针组包括针对至少一 个微卫星位点的侧翼探针， 侧翼探针覆盖至少一 个微卫星位点序列的侧翼序列； 利用探针组捕获 目标序列。 本发 明的侧翼探针与常规野生型探针 相比不仅能够 有效避开GC异常的区域， 而且能够 有效弥补丢失的有效测序读段， 进而显著提高微 卫星位点的覆盖度。 此外， 本发明独特的探针设 计能够大大提高靶点的捕获效率， 提高探针的特 异性和GC均一性。 因此， 本发明的探针组、 系统、 检测方法在癌症相关微卫星检测 中具有较高的 检测价值以及临床价 值和广阔的应用前 景。 权利要求书1页 说明书17页 附图2页 CN 114085912 A 2022.02.25 CN 114085912 A 1.一种用于二代测序微 卫星不稳定位 点检测的方法， 其特 征在于， 其包括以下步骤： (1) 选择至少一个微 卫星位点作为靶标； (2) 设计针对靶标的探针组， 其中， 所述探针组包括针对至少一个微卫星位点的侧翼 探针， 所述侧翼探针覆盖所述至少一个微 卫星位点序列的侧翼序列； (3) 利用所述探针组捕获目标序列。 2.根据权利要求1所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法， 其特征在于， 所 述侧翼序列包括微卫星位点序列的5 ’端序列， 且与所述微卫星位点序列的距离为0 ‑20 bp； 和/或所述侧翼序列包括微卫星位点序列的3 ’端序列， 且与所述微卫星位点序列的距离为 0‑20 bp。 3.根据权利要求1所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法， 其特征在于， 所 述探针组进一步包括野生型探针， 所述野生型探针覆盖对应微卫星位点的序列且与之完全 匹配。 4.根据权利要求3所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法， 其特征在于， 针 对各微卫星位点的探针由一条野生型探针和两条侧翼探针组成， 且两条侧翼探针分别覆盖 对应微卫星位点的5’端和3’端之一。 5.根据权利要求1所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的方法， 其特征在于， 进 一步包括优化探针， 其为当候选侧翼探针的特异 性差时在所述候选侧翼探针的基础上向所 述微卫星位点移动从而 使探针覆盖微 卫星位点中小于10个碱基而形成的探针。 6.用于二代测序微 卫星不稳定位 点检测的系统， 其特 征在于， 其包括： 获取测序数据单元， 所述测序数据含有与权利要求1中所述的微卫星位点对应的测序 读段； 数据处理单元， 所述数据处理单元通过数据处理得到用于微卫星不稳定性多态性分析 的有效数据； 微卫星不稳定性多态性分析单元， 基于所述有效数据， 确定重复单元的改变， 并输出微 卫星不稳定性状态。 7.一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组， 其特征在于， 所述探针组包括 针对至少一个微卫星位点的侧翼探针， 所述侧翼探针覆盖所述至少一个微卫星位点序列的 侧翼序列。 8.根据权利要求7所述的用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组， 其特征在于， 所述至少一个微 卫星位点选自由表 2所示的微 卫星位点所组成的组。 9.一种用于二代测序微卫星不稳定位点检测的试剂盒， 其特征在于， 包括根据权利要 求7或8任一项所述的探针组和说明书， 其中， 所述说明书包括如何使用所述探针组进行微 卫星不稳定位 点的检测以及微 卫星不稳定的判断标准。 10.根据权利要求7或8任一项所述的探针组或根据权利要求9所述的试剂盒在癌症相 关的微卫星不稳定位点检测中的用途， 其特征在于， 所述癌症包括胃癌、 结直肠癌、 食管癌、 子宫内膜癌、 肝细胞癌、 乳腺癌和卵巢癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114085912 A 2用于二代测序微卫星不稳定位点检测的探针组、 系统、 检测方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测领域， 具体地涉及用于二代测 序微卫星不稳定位点检测的探 针组、 系统、 检测方法及其应用。 背景技术 [0002]微卫星不稳定性(Micr osatellite  Instability,  MSI)， 是指由于在DNA复制时插 入或缺失突变引起的微卫星(Microsatellite,  MS)序列长度改变的现象。 MSI在结直肠癌， 在子宫内膜癌、 胃癌、 肝细胞癌、 乳腺癌等实体瘤中均有发生。 [0003]临床研究证实， MSI与结直肠癌的预后有着密切的关系。 MSI ‑H结直肠癌患者相比 MSS患者具有显著的生存优势， 临床表现较差， 但预后更好。 研究证实， 针对 Ⅱ/Ⅲ期结直肠 癌患者， MSI ‑H患者的总生存期及无病生存期明显延长。 美国国家综合癌症网络(National   Comprehensive Cancer Network,  NCCN)发布的结直肠癌指南， 建议MSI检测应在所有结直 肠癌史的病人中进行。 [0004]目前检测癌细胞中的MS I时， 既可以通过检测MM R基因缺失来确定是否发生MS I， 如 依赖于免疫组化 技术的蛋白水平检测， 也可以直接检测MSI的序列变化。 具体包括： (一) 免疫组化方法(Im munohistochemistry, IHC) 常见的方法为采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中错配修复基因MLH1、 MSH2、 MSH6及PMS2的表达。 此方法检测MSI相对较简单， 成本较低。 但存在一些问题， 如 使用抗体的 不一致、 病理医生的阅片标准 不一致等。 [0005](二) 分子水平的检测 1. 聚合酶链反应(po lymerase chain reaction, PCR)技术 目前主要采用多重荧光PC R结合毛细管电泳的方法。 通过PC R方法检测特异的微卫 星重复序列扩增判定MSI状态， 比较肿瘤患者的标本组织与正常组织的位点突变情况。 大量 的实验证实， MMR免疫组化检测结果与MS的PCR检测结果有高度关联性， 灵敏度92%， 特异性 可达100%。 [0006]该方法目前是检测MSI 的方法学“金标准”， 但操作过程复杂， 花费较高， 且在结果 判断中会碰到以下问题， 如荧光的过强或过少、 非特异性峰、 不显著的峰大小改变， 杂合性 缺失等。 [0007]2. 新一代测序方法(Next  Generati on Sequenci ng, NGS) NGS又称为第二代测 序技术， 是一种高通量测 序技术， 能一次性对几十万到几百万 条基因分子进行序列测 定。 目前NGS方法已经成为检测 MSI的新工具， 其最大优势是可以实 现多位点高通量检测。 实验证明， NGS方法较MSI ‑PCR方法具有更高的敏感性。 [0008]目前仍亟需一种基于第二代测序技术实现微卫星不稳定位点的方便、 高效、 准确 检测的探针组、 检测方法及系统。 [0009]背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景， 不应视为承认或以任何形 式说　明　书 1/17 页 3 CN 114085912 A 3