(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210069256.2 (22)申请日 2022.01.20 (71)申请人 天津市农业科 学院 地址 300192 天津市南 开区航天道 26号 (72)发明人 杨秀荣　闫双勇　李月娇　孙淑琴　 李广胜　 (74)专利代理 机构 北京百欧知识产权代理事务 所(普通合伙) 11930 代理人 邹晓艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴定水稻Pik座位多个稻瘟病抗性等位 基因的功能标记组、 引物组合及其应用 (57)摘要 本发明公开了用于鉴定水稻Pik座位多个稻 瘟病抗性等位基因的功能标记组， 所述功能标记 组为KASP功能标记组， 包括功能标记MPik1、 MPik2、 MPik3、 MPik4、 MPik5， 所述稻瘟病抗性等 位基因包括Pi1、 Pikm_TS、 PiKs、 PiKa、 Pik、 PiKp 和Pi7。 还公开了用于检测功能标记组的成套的 KASP引物组及检测方法。 通过在不同抗病等位基 因及感病基因间进行多序列比对， 从中筛选出可 以用于区分Pik座位不同等位基因的SNP位点， 在 此基础上成功开发了可用于Pik座位抗感基因区 分， 以及不同抗性等位基因区分的功能标记组； 用这些功能标记组可以准确区分不同的抗性等 位基因， 有重要育种应用价 值。 权利要求书3页 说明书14页 序列表9页 附图2页 CN 114410819 A 2022.04.29 CN 114410819 A 1.用于鉴定水稻Pik座位多个稻瘟病抗性等位基因 的功能标记 组， 其特征在于： 所述功 能标记组为KASP功能标记组， 包括功能标记MPik1、 MPik2、 MPik3、 MPik4、 MPik5， 所述稻瘟病 抗性等位基因包括Pi1、 Pikm_TS、 PiKs、 PiKa、 Pik、 PiKp和Pi7， 标记MPik1、 MPik2、 MPik3、 MPik4、 MPik5检测的SNP/I ndel位点基因型与等 位基因的对应关系如下表所示： MPik1 MPik2 MPik3 MPik4 MPik5 Pi1 T AA T T T Pikm_TS T AA T A T PiKs T AA T A C PiKa C AA G A T Pik T AA T A T PiKp C GC G A C Pi7 C AA G A C 所述SNP/I ndel位点的具体位置如下表中所示： 标记编号 分子标记类型 物理位置 差异碱基 MPik_1 SNP Pi1基因序列的第2040位 [T/C] MPik_2 SNP Pi1基因序列的第8 824位 [AA/GC] MPik_3 Indel Pi1基因序列的第489位 [GC/T] MPik_4 Indel Pi1基因序列的第1 1284位 [T/AA] MPik_5 SNP Pi1基因序列的第5419位 [T/C] 表中所述Pi1基因的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示。 2.用于检测权利要求1所述的功能标记组的成套的KASP引物组， 其特征在于： 由如下 (1)‑(5)组成： (1)用于检测MPik1的KASP引物组： 引物1、 引物2和引物3， 所述引物1为自5 ’端到3’端依 次为标签序列A和序列表 中序列1的第22 ‑44位的单链DNA， 所述引物2为自5 ’端到3’端依次 为标签序列B和序列表 中序列2的第22 ‑44位的单链DNA， 所述引物3为核苷酸序列如序列表 中序列3所示的单链DNA； (2)用于检测MPik2的KASP引物组： 引物4、 引物5和引物6， 所述引物4为自5 ’端到3’端依 次为标签序列A和序列表 中序列4的第22 ‑44位的单链DNA， 所述引物5为自5 ’端到3’端依次 为标签序列B和序列表 中序列5的第22 ‑41位的单链DNA， 所述引物6为核苷酸序列如序列表 中序列6所示的单链DNA； (3)用于检测MPik3的KASP引物组： 引物7、 引物8和引物9， 所述引物7为自5 ’端到3’端依 次为标签序列A和序列表 中序列7的第22 ‑42位的单链DNA， 所述引物8为自5 ’端到3’端依次 为标签序列B和序列表 中序列8的第22 ‑41位的单链DNA， 所述引物9为核苷酸序列如序列表 中序列9所示的单链DNA； (4)用于检测MPik4的KASP引物组： 引物10、 引物11和引物12， 所述引物10为自5 ’端到3’ 端依次为标签序列A和序列表中序列10的第22 ‑46位的单链DNA， 所述引物11为自5 ’端到3’ 端依次为标签序列B和序列表 中序列11的第22 ‑46位的单链DNA， 所述引物12为核苷酸序列 如序列表中序列12所示的单链DNA； (5)用于检测MPik5的KASP引物组： 引物13、 引物14和引物15， 所述引物13为自5 ’端到3’权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114410819 A 2端依次为标签序列A和序列表中序列13的第22 ‑42位的单链DNA， 所述引物14为自5 ’端到3’ 端依次为标签序列B和序列表 中序列14的第22 ‑40位的单链DNA， 所述引物15为核苷酸序列 如序列表中序列15所示的单链DNA。 3.如权利要求2所述的KASP引物组， 其特征在于： 所述标签序列A为FAM荧光标签序列， 所述标签序列B为H EX荧光标签序列。 4.如权利 要求3所述的KASP引物组， 其特征在于： 所述引物1 ‑15的序列依次如序列表中 SEQ ID NO.1～15所示。 5.权利要求1所述的功能标记组在鉴定或者辅助鉴定水稻Pik座位的稻瘟病抗性等位 基因类型或者在水稻分子标记辅助育种中的应用。 6.权利要2至4任一所述的KASP引物 组在鉴定或者辅助鉴定水稻Pik座位的稻瘟病抗性 等位基因类型或者在水稻分子标记辅助育种中的应用。 7.一种鉴定水稻Pik座位多个稻瘟病抗性等位基因的方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： 1)提取待测水稻样品的基因 组DNA； 2)使用权利要求3所述的引物组合对提取的基因组DNA进行PCR扩增， 检测扩增产物中 的KASP功能标记组中的SNP/Indel位点， 每个标记单独扩增， 根据权利要求1中的表中功能 标记MPik1、 MPik2、 MPik3、 MPik4、 MPik5 中SNP/Indel位点基因型与等位基因的对应关系来 判断待测样品的Pik座位稻瘟病抗性等位基因为Pi1、 Pikm_TS、 PiKs、 PiKa、 Pik、 PiKp、 Pi7中 的哪一种。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于： 采用权利要求4所述的引物组合进行PCR扩 增， 采用荧光检测仪检测扩增产物， 根据荧光信号判断功能标记MPik1、 MPik2、 MPik3、 MPik4、 MPik5中差异位 点基因型， 对应关系为下表所示： 9.如权利要求8所述的方法， 其特 征在于： PCR反应体系 为10ul的体系： 含1.0ul  10×PARMS Buffer， 1.0ul  dNTP， 每组KASP引物 的3条引物各1.0ul， 每条引物的浓度为4mol ·L‑1， 0.2ul PARMS PCR酶， 30～50ng/ul的模 板 DNA 1.0ul， 3.8ul  ddH2O。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于： PCR反应程序为： 94℃5min； 94℃30s， 58℃权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114410819 A 3