(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210066295.7 (22)申请日 2022.01.20 (71)申请人 北京市农林科 学院 地址 100097 北京市海淀区曙光 花园中路9 号 (72)发明人 田文　邱艳红　徐秀兰　张海军　 (74)专利代理 机构 北京五洲洋和知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11387 代理人 荣红颖　刘春成 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种能够同步扩增4种瓜类病毒的引物组及 其方法和应用 (57)摘要 本发明属于瓜类病毒病害诊断和分子生物 学技术领域， 公开了一种能够同步扩增SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种瓜类病毒基因组片段的 引物组， 所述引物组包括： 第一引物对、 第二引物 对、 第三引 物对和第四引物对(SEQIDNO1 ‑8)， 在 一个PCR反应体系中， 以4种病毒混合阳性的样本 的cDNA为模板进行扩增， 能够得到1224bp、 831bp、 440bp和2 06bp的特异性条带， 建立并优 化 了能同时检测植物SqMV、 CGMMV、 ZYMV、 CiLCV的单 重或多重感染的RT ‑PCR反应体系。 检测结果表明 优化后的多重RT ‑PCR体系能够对田间所采集的 样品进行快速、 高效、 灵敏的检测。 对监测瓜类作 物上这4种常见病毒的发生情况以及病害流行预 测具有十分重要的意 义。 权利要求书3页 说明书14页 序列表4页 附图6页 CN 114231667 A 2022.03.25 CN 114231667 A 1.一种能够同步扩增SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种瓜类病毒基因组片段的引物组， 所 述引物组包括： 第一引物对、 第二引物对、 第三引物对和第四引物对； 所述第一引物对中的正向引物SqMV ‑1224‑F， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述 第一引物对中的反向引物SqMV ‑1224‑R， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述第二引物对中的正向引物CGMMV ‑831‑F， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述 第二引物对中的反向引物CGM MV‑831‑R， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述第三引物对中的正向引物ZYMV ‑440‑F， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述第 三引物对中的反向引物ZY MV‑440‑R， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 所述第四引物对中的正向引物CiLCV ‑206‑F， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 所述 第四引物对中的反向引物Ci LCV‑206‑F， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示。 2.一种能够同步扩增SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种瓜类病毒基因组片段的试剂， 所述 试剂包括权利要求1所述的引物组。 3.根据权利要求2所述的试剂， 所述试剂中第一引物对： 第 二引物对： 第 三引物对： 第四 引物对的总摩尔比值为： 1:1:2:1或2:2:4:3或2:3:6:5或2:3:7:6； 优选地， 所述试剂中第一 引物对： 第二引物对： 第三引物对： 第四引物对的总摩尔比值 为： 2:3:5:4。 4.一种能够同步扩增SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种瓜类病毒基因组片段的试剂盒， 所 述试剂盒中含有权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂； 所述试剂盒还包括 用于RT‑PCR扩增的辅助试剂； 优选地， 所述辅助试剂还 包括反转录酶和/或DNA聚合酶； 优选地， 所述辅助试剂还 包括阳性对照样品。 5.权利要求1所述的引物 组、 权利要求2或3所述的试剂 或权利要求4所述的试剂 盒在如 下a1或a2中的应用： a1、 同步检测SqMV、 CGM MV、 ZYMV和CiLCV四种瓜 类病毒； a2、 制备同步检测SqMV、 CGM MV、 ZYMV和CiLCV四种瓜 类病毒的制剂。 6.如权利要求5所述的应用， 其特征在于， a1是指： 检测待测植物材料是否感染SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种瓜类病毒 中的四种、 任意三种、 任意两种或任意一种； 或检测 待测 病毒是否为SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种瓜类病毒 中的四种、 任意三种、 任意两种或任意 一种； 优选地， a2是指： 制备检测待测植物材料是否感染SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV中至少一 种瓜类病毒的制剂； 或制备检测待测病毒是否为SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV中至少一种瓜类 病毒的制剂。 7.一种检测待测植物材料是否感染SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV中至少一种瓜类病毒的 方法， 所述方法包括： b1、 采用权利要求1所述的引物组对所述待测植物材料的核酸进行PCR扩增； b2、 根据所 述扩增的产物确定所述待测植物材料是否感染SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种 瓜类病毒中 的四种、 任意三种、 任意两种或任意 一种。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述待测植物材料为植物叶片或种子； 优选 地， 所述待测植材 料物为瓜 类作物的植物叶片或种子； 优选地， 所述待测植物材 料的核酸 为所述待测植物材 料的总RNA；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114231667 A 2优选地， 所述PCR扩增为RT ‑PCR扩增， 其中， 先将所述总RNA反转录成cDNA， 然后再以 cDNA作为模板构建多重PCR体系； 优选地， 所述确定 的步骤为： 表征所述PCR扩增产物中的DNA片段， 当所述PCR扩增产物 中不含有1224bp的DNA片段时， 判定所述待测植物材料中没有感染所述SqMV病毒， 当所述 PCR扩增产物中含有12 24bp的DNA片段时， 判定所述待测植物材 料中感染了所述SqMV病毒； 当所述PCR扩增产物中不含有831bp的DNA片段时， 判定所述待测植物材料中没有感染 所述CGMMV病毒， 当所述PCR扩增产物中含有831bp的DNA片段时， 判定所述待测植物材料中 感染了所述CGM MV病毒； 当所述PCR扩增产物中不含有440bp的DNA片段时， 判定所述待测植物材料中没有感染 所述ZYMV病毒， 当所述PCR扩增产物中含有440b p的DNA片段时， 判定所述待测植物材料中感 染了所述ZY MV病毒； 当所述PCR扩增产物中不含有206bp的DNA片段时， 判定所述待测植物材料中没有感染 所述CiLCV病毒， 当所述PCR扩增产物中含有206bp的DNA片段时， 判定所述待测植物材料中 感染了所述Ci LCV病毒； 优选地， 所述表征 是通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实现的； 优选地， 所述PCR扩增采用的温度程序为： (1)95℃反应3mi n； (2)循环反应； (3)72℃反应5mi n； 所述循环反应步骤为： 95℃反应15s； 52 ‑60℃反应15s； 72℃反应20s， 循环3 0次； 优选地， 所述循环反应步骤为： 95℃反应15s； 59.4℃反应15s； 72℃反应20s， 循环3 0次； 优选地， 所述多重PCR体系中， 第一引物对： 第二引物对： 第三引物对： 第四引物对 的总 摩尔比值为： 1: 1:2:1或2:2:4:3或2:3:6:5或2:3:7:6； 优选地， 所述试剂中第一引物对： 第 二引物对： 第三引物对： 第四引物对的总摩尔比值 为： 2:3:5:4； 优选地， 所述多重PCR体系 总体积为25 μL， 其中： 所述cDNA模板在体系中的终浓度为10 ‑200ng/ μL； 进一 步优选为5 0ng/ μL。 9.一种检测待测病毒是否为SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV中至少一种瓜类病毒的方法， 所 述方法包括： c1、 采用权利要求1所述的引物组对所述待测病毒样本的核酸进行PCR扩增； c2、 根据所 述扩增的产物确定所述待测病毒是否为SqMV、 CGMMV、 ZYMV和CiLCV四种瓜类病毒中的四种、 任意三种、 任意两种或任意 一种。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述待测病毒样本的核酸为所述待测病毒 样本的总RNA； 优选地， 所述PCR扩增为RT ‑PCR扩增， 其中， 先将所述总RNA反转录成cDNA， 然后再以 cDNA作为模板构建多重PCR体系； 优选地， 所述确定 的步骤为： 表征所述PCR扩增产物中的DNA片段， 当所述PCR扩增产物 中不含有1224bp的DNA片段时， 判 定所述待测病毒样本中不含有所述SqMV病毒； 当所述PCR 扩增产物中含有12 24bp的DNA片段时， 判定所述待测病毒样本中含有所述SqMV病毒； 当所述PCR扩增产物中不含有831bp的DNA片段时， 判定所述待测病毒样本中不含有所权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114231667 A 3