(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210072008.3 (22)申请日 2022.01.21 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114085930 A (43)申请公布日 2022.02.25 (73)专利权人 广州国家实验室 地址 510005 广东省广州市海珠区广州国 际生物岛星岛环北路9号 专利权人 南京邮电大 学　 广州金域医学检验中心有限公司 (72)发明人 缪夏萍　张晶晶　于世辉　汪联辉　 陈娜　宋春元　 (74)专利代理 机构 广州广典知识产权代理事务 所(普通合伙) 44365 代理人 万志香 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/65(2006.01) (56)对比文件 CN 113549712 A,2021.10.26CN 10285896 0 A,2013.01.02 CN 113092441 A,2021.07.09 CN 104764790 A,2015.07.08 CN 111443072 A,2020.07.24 WO 2021219 969 A1,2021.1 1.04 CN 111441022 A,2020.07.24 CN 111665356 A,2020.09.15 CN 111781186 A,2020.10.16 Hsin-Neng Wang等.Surface-enhanced Raman scat tering molecular senti nel nanoprobes for viral i nfection diagnostics. 《Anal C him Acta》 .2013,第786卷 第153-158. SuJuan Ye等.Dual-primer self- generati on SERS signal ampl ification assay for P DGF-BB using label-fre e aptamer. 《Bi osens Bi oelectro n》 .2015,第79卷 第130-135页. 程建祥.银纳米 颗粒阵列的可控制备及SERS 性能. 《中国优秀博硕士学位 论文全文数据库(硕 士)工程科技 Ⅰ辑》 .2021,(第04期),第B014-287 页. 审查员 马妍妍 (54)发明名称 用于检测SARS-CoV-2核酸的SERS检测试剂 盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测SARS ‑CoV‑2核 酸的SERS检测试剂盒及方法， 所述SERS检测试剂 盒包括SERS检测芯片、 第一试剂、 第二试剂和第 三试剂。 本发明的SERS检测试剂盒通过SERS检测 芯片、 第一试剂、 第二试剂和第三试剂的相互配 合， 检测SERS检测芯片上SERS探针的拉曼信号， 就可以实现对于SARS ‑CoV‑2核酸的快速、 特异性 及高灵敏检测， 可进一步应用于更快、 更灵敏、 多 渠道和现场即时的病毒 核酸检测。 权利要求书2页 说明书11页 序列表1页 附图4页 CN 114085930 B 2022.04.12 CN 114085930 B 1.一种用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒， 其特征在于， 所述SERS检测试剂 盒包括： (1)、 SERS检测芯片 所述SERS检测芯片为表面修饰有序列如SEQ  ID NO.4所示的捕获单链的银纳米棒阵列 基片； (2)、 第一试剂 所述第一试剂是由序列如SEQ  ID NO.1所示 的辅助单链和序列如SEQ  ID NO.2所示 的 发夹型DNA单链H1混合并于90℃~95℃退火而得； 所述辅助单链和发夹型DNA单链H1的浓度 比为1： 0.8~2； (3)、 第二试剂 所述第二试剂为序列如SEQ  ID NO.3所示的发夹型DNA单链H2； (4)、 第三试剂 所述第三试剂为表面修饰有序列如SEQ  ID NO.5所示的探针单链和5,5 ’ ‑二硫代双(2 ‑ 硝基苯甲酸)的金纳米颗粒， 所述探针单链和5,5 ’ ‑二硫代双(2 ‑硝基苯甲酸)的浓度比为 1： 1~3。 2.根据权利要求1所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒， 其特征在于， 所 述银纳米棒阵列基片包括3 ×10阵列型小孔， 每个所述小孔的孔径 为3 mm~5 mm， 深度为0.8   mm~1.2 mm。 3.根据权利要求1所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒， 其特征在于， 所 述辅助单链和发夹型DNA单链H1的浓度比为1： 1~1.25。 4.根据权利要求1所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒， 其特征在于， 所 述金纳米颗粒的粒径为15  nm~100 nm。 5.根据权利要求1~4任一项所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒， 其特 征在于， 所述第一试剂的工作浓度为5  μM~10 μM； 和/或所述第二试剂的工作浓度为5  μM~ 20 μM； 和/或所述第三试剂的工作浓度为0.1  nM~10 nM。 6.根据权利要求5所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒， 其特征在于， 所 述第三试剂的工作浓度为3.2  nM~3.4 nM。 7.一种用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒的制备方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： (1)、 制备SERS检测芯片 按摩尔比1： 100~1000的比例， 将浓度为500  nM~2000 nM、 序列如SEQ  ID NO.4所示的捕 获单链与三羧乙基膦溶液混合， 25℃~37℃恒温混匀仪中反应4小时~12小时， 再与银纳米棒 阵列基片共培养3小时~5小时， TM缓冲液清洗后， 即得； 所述共培养条件为： 温度 25℃~37℃， 湿度60%~80%； 所述捕获单链的5'端连接有 ‑(CH2)6‑SH基团； (2)、 制备第一试剂 将序列如SEQ  ID NO.1所示的辅助单链和序列如SEQ  ID NO.2所示的发夹型DNA单链 H1， 按浓度比为1： 0.8~2的比例混合并于90℃~95℃退火4  min~6 min， 即得； (3)、 制备第二试剂 根据发夹型DNA单链H1设计并合成具有如SEQ  ID NO.3所示序列的发夹型DNA单链H2；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114085930 B 2(4)、 制备第三试剂 按摩尔比1： 100~1000的比例， 将序列如SEQ  ID NO.5所示 的探针单链与三羧乙基膦溶 液混合， 25℃~37℃恒温混匀仪中反应4小时~12小时后， 取8  μL~12 μL 10 μM~100 μM探针 单链与450  μL~550 μL 0.1 nM~10 nM金纳米颗粒溶液混合于TBE溶液中培养过夜； 分批加 入NaCl溶液至混合物中NaCl的最终浓度为160  mM~200 mM， 共培养过夜； 加入8  μL~12 μL  5,5’ ‑二硫代双(2 ‑硝基苯甲酸)反应2.5小时~3.5小时； 离心去除上清液， TBE溶液分散离心 沉积物定容， 即得， 所述5,5 ’ ‑二硫代双(2 ‑硝基苯甲酸)与探针单链的浓度比为1~3： 1； 所述 探针单链的3'端连接有 ‑(CH2)6‑SH基团。 8.根据权利要求7所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒的制 备方法， 其 特征在于， 步骤(1)制备SERS检测芯片时， 所述TM缓冲液清洗后， 还包括： 滴加15  μL~25 μL  0.5 mM~2 mM 6‑巯基己醇至银纳米棒阵列表面， 25℃~37℃恒温混匀仪中反应8分钟~12分 钟的步骤。 9.根据权利要求7所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒的制 备方法， 其 特征在于， 步骤(1)中， 所述捕获单链的浓度为5 00 nM~1000 nM。 10.一种基于SERS的非诊断目的SA RS‑CoV‑2核酸的检测方法， 其特征在于， 使用权利要 求1~6任一项所述的用于检测SARS ‑CoV‑2核酸的SERS检测试剂盒进行检测， 所述检测方法 包括以下步骤： (1)、 将待检测样品与第一试剂、 第二试剂和第三试剂混合后滴加至SERS检测芯片表 面， 25℃~37℃， 200 rpm~400 rpm培养40分钟~60分钟； (2)、 超纯水清洗SERS检测芯片， 对SERS检测芯片进行SERS检测， 得到SERS光谱及其特 征峰信号强度值， 根据工作曲线计算得到待检测样品中SARS ‑CoV‑2核酸的浓度； 所述工作曲线是通过以下步骤绘制而成： (a)、 将第一试剂、 第二试剂、 第三试剂与浓度分别为102 copies/mL、 103 copies/mL、 104  copies/mL、 105 copies/mL、 106 copies/mL  SARS‑CoV‑2核酸标准品溶液混合， 滴加至SERS 检测芯片表面， 25℃~37℃， 200 rpm~400 rpm培养40分钟~60分钟； (b)、 超纯水清洗SERS检测芯片， 对SERS检测芯片进行SERS