(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210076523.9 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 中国检验检疫科 学研究院 地址 100176 北京市大兴区亦庄经济技 术 开发区荣 华南路11号 (72)发明人 宋云　姜帆　朱水芳　石俊霞　 相宁　 (74)专利代理 机构 北京百欧知识产权代理事务 所(普通合伙) 11930 代理人 邹晓艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴定曼陀罗属有毒植物的高灵敏度引 物组、 试剂盒和方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于鉴定有毒曼陀罗属 植物的引物组、 试剂盒和鉴定方法， 所述引物组 包括引物da  F、 da R， 其核苷酸序列为： da  F： 5’ ‑ CAAAAACCTTGGCTGCGGTT ‑3’； da R： 5’‑ TGAAGGGTCTAGGAGCACAAA ‑3’。 鉴定方法包括步 骤： 1)提取待测样品的基因组DNA； 2)采用所述的 引物组或者试剂盒， 对提取的基因组DNA进行PCR 扩增； 3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增 片段， 含有目的扩增片段的样品鉴定为有毒曼陀 罗属植物阳性。 本发明能够快速、 准确地将有毒 曼陀罗属植物与其它易混淆材料快速区分开来， 检测特异性强， 灵敏度高达1ng/μl。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114410820 A 2022.04.29 CN 114410820 A 1.一种用于鉴定有毒曼陀罗属植物的引物 组， 其特征在于： 所述引物 组包括引物da  F、 da R， 其核苷酸序列为： da F： 5’ ‑CAAAAACCTTGGCTGCGGTT‑3’； da R： 5’ ‑TGAAGGGTCTAGGAGCACAAA‑3’。 2.如权利要求1所述的引物组， 其特征在于： 还包括探针da  P， 探针da  P的核苷酸序列 为： TGGTGGTTGGAACTCAACTCTCGT； 优选探针da  P的5’端标记荧光报告基团， 3 ’端标记荧光淬灭基团； 进一步优选所述荧 光报告基团为FAM， 所述 荧光淬灭基团为BHQ1。 3.如权利要求1或2所述的引物组， 其特征在于： 所述有毒曼陀罗属植物包括毛曼陀罗 Datura innoxia、 洋金花Datura  metel、 曼陀罗Datura  stramonium。 4.一种用于鉴定有毒曼陀罗属植物的试剂盒， 其特征在于： 包含权利要求1或2所述的 引物组， 还 包含PCR扩增或者实时荧 光PCR扩增的反应试剂。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于： 还包括DNA提取试剂、 阳性对照和阴性对 照， 所述PCR扩增或者实时荧 光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶 缓冲液。 6.一种鉴定有 毒曼陀罗属植物的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)提取待测样品的基因 组DNA； 2)采用权利 要求1所述的引物组或者权利 要求4或5所述的试剂盒， 对提取的基因组DNA 进行PCR扩增； 3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段， 含有目的扩增片段的样品鉴定为有毒 曼陀罗属植物阳性， 所述目的扩增片段的大小为181bp。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于： 所述PCR扩增的反应体系为： 总体积25μl， 其中， 2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl、 浓度为10 μM的正反向引物各 1 μl、 基因组DNA  1 μl、 余 量为ddH2O； 所述步骤2)中PCR扩增的反应条件为： 94℃3min； 94℃30s,54℃30s,72℃1min,循环30 次； 72℃5mi n； 优选所述 步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条 带。 8.一种鉴定有 毒曼陀罗属植物的实时荧 光PCR方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)提取待测样品的基因 组DNA； 2)采用权利 要求2所述的引物组或者权利 要求4或5所述的试剂盒， 对提取的基因组DNA 进行实时荧光P CR扩增， 根据扩增结果判断待测对象是否含有有毒 曼陀罗属植物， 如果Ct＜ 30则判断为曼陀罗属物种阳性， Ct≥3 0则判断为曼陀罗属物种阴性。 9.根据权利 要求8所述的方法， 其特征在于： 所述实时荧光PCR的反应体系为： 总体积20 μl， 其中2 ×Premix Ex Taq 10 μl、 浓度为10 μM的引物da  F/da R各1μl、 浓度为10 μM的探针 da P 0.5 μl、 基因组DNA  1μl， 余量为 ddH2O； qPCR扩增程序为： 95℃预变性20s， 40个循环的 95℃变性3s、 54℃退火3 0s。 10.权利要求1或2所述的引物 组或者权利要求4或5所述的试剂 盒在鉴定有毒曼陀罗属 植物中的应用； 优选所述有毒曼陀罗属植物包括毛曼陀罗Datura  innoxia、 洋金花Datura   metel、 曼陀罗Datura  stramonium。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410820 A 2用于鉴定曼陀罗属有毒植物的高灵敏度引物组、 试剂盒和 方法 技术领域 [0001]本发明涉及曼陀罗属植物鉴定技术领域， 具体涉及一种用于鉴定曼陀罗属有毒植 物的高灵敏度引物组、 试剂盒和方法。 背景技术 [0002]近年来我国有毒生物引发的中毒事件屡见报道， 已成为对公众健康较为严重的公 共卫生问题， 有毒生物主要包括产毒微生物、 有毒动植物以及毒蘑菇。 据统计， 微生物是导 致食物中毒首要原因， 但有毒动植物和毒蘑菇是导致中毒致死的主要原因。 有毒植物是指 凡有中毒实例或实验证实有 可能通过食入、 接触或其他途径进入机体， 造成人、 家畜或其他 某些动物死亡或机体机能长期性或 暂时性伤害的植物， 均称为有毒植物。 由于其存在广泛、 易获得， 民间一向有采摘野生植物食用的习惯， 而且在中医治疗中大量使用各类中草药， 误 食和接触有毒植物的机会较多， 易被误认为食材或药材， 此外， 一些重要的经济作物、 食用 植物以及许多园林观 赏植物等都具有或大或小的毒性， 由此而导致的植物中毒事件也并不 罕见。 有毒植物对人们的生活影响广泛而突出。 有毒植物可引起急性、 慢性中毒， 部分植物 具有致突变、 癌变、 畸胎等效应。 我国有 毒植物有约13 00种， 分布于140科。 [0003]曼陀罗属为茄科植物， 该属植物全株都有剧毒， 以种子毒性最大， 其次为嫩叶、 叶、 花、 根、 茎。 洋金花(学名： Datura  metelL)， 别名闹洋花、 凤茄花、 风茄花、 曼陀罗花， 是白花 曼陀罗属植物， 中药洋 金花一般指白花曼陀罗的干燥花。 临床报道以误食曼陀罗籽、 花朵或 自制曼陀罗药酒中毒多 见。 曼陀罗的幼 苗容易与野菜、 菠菜、 荠菜等可食用的野菜混淆而导 致误食中毒； 花似喇叭， 儿童易误食引起中毒； 药店将患者求购的龙脷叶误抓成曼陀罗干花 卖给患者导致中毒， 由于药房在中药配方中误将洋 金花取代凌霄花， 数次引起患者中毒； 国 内外曾有 药农将洋 金花冒充凌霄花出售的报道； 或者洋 金花煮水口服， 当成金银花， 致使儿 童洋金花中毒； 各种曼陀罗属有 毒植物中毒事 件屡有发生。 [0004]在世界范围内均时有曼陀罗种植及中毒的报道， 误诊是曼陀罗中毒治疗中最大的 障碍。 早期、 快速、 准确诊断， 尽快加快毒物的清除， 对症使用解毒剂， 是提高抢救成功率和 治愈率的关键 。 发明内容 [0005]本发明的目的是针对上述问题， 提供一种能够快速、 准确鉴定曼陀罗属有毒植物 的高灵敏度引物组、 试剂盒， 具体技 术方案如下： [0006]一种用于鉴定有毒曼陀罗属植物的引物组， 所述引物组包括引物da  F、 da R， 其核 苷酸序列为： [0007]da F： 5’ ‑CAAAAACCTTGGCTGCGGTT‑3’； [0008]da R： 5’ ‑TGAAGGGTCTAGGAGCACAAA‑3’。 [0009]在另一技术方案中， 所述引物组还包括探针da  P， 探针da  P的核苷酸序列为：说　明　书 1/5 页 3 CN 114410820 A 3