(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210071448.7 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 南京邮电大 学 地址 224100 江苏省盐城市 盐南高新区大 数据产业园创新大厦南楼15层 (72)发明人 武灵芝　龚靖哲　王宇朋　翁丽星　 胡岚　 (74)专利代理 机构 南京正联知识产权代理有限 公司 32243 专利代理师 卢霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6825(2018.01) C12Q 1/48(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测探针、 试剂盒及 端粒酶活性的直接 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测探针、 试剂盒及 端粒 酶活性的直接检测方法， 本发明所述的检测探针 包括金纳米颗粒及包覆在表面的双嵌段DNA1和 DNA2。 双嵌段DNA1能与端粒酶引物序列杂交互 补， 同时DNA1与DNA2具有互补序列杂交引发金纳 米颗粒组装形成二聚体。 端粒酶加入后， 以引物 为模板， 延伸端粒， 引发DNA2链的解链置换， 从而 发生纳米颗粒二聚体解离形成单体； 由于纳米颗 粒体积大小与阻塞电流信号呈正比， 因此， 加入 端粒酶前后的检测探针在通过纳米孔时产生了 差异更加明显的电信号， 从而具有更高的信噪 比， 实现高灵敏的检测端粒酶活性。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114438171 A 2022.05.06 CN 114438171 A 1.一种检测探针， 用于端粒酶活性高灵敏度检测， 其特征在于， 所述检测探针包括： 两 个金纳米颗粒载体、 分别修饰两个金纳米颗粒的双嵌段DNA1和双嵌段DNA2、 作为端粒酶作用 位点的端粒酶引物序列； 所述双嵌段DNA1和双嵌段DNA2均包括锚 定链和连接链， 所述双嵌段 DNA1和双嵌段DNA2的锚定链均为polyA序列， 所述锚定链用于锚定所述金纳米颗粒， 因此所 述锚定链的长度由所述金纳米颗粒的直径决定， 所述双嵌段DNA1的连接链前段与端粒酶引 物序列部分互补或完全互补、 后段与DNA2连接链部分互补或完全互补， 从而形成稳定的二 聚体结构； 所述双嵌段DNA1的连接链前 段指的是与双嵌段DNA1锚定链直接相连的序列。 2.根据权利要求1所述的检测探针， 其特 征在于， 所述金纳米颗粒尺寸 为5‑20nm。 3.根据权利 要求1所述的检测探针， 其特征在于， 所述端粒酶引物序列长度为15 ‑20nt、 所述双嵌段DNA1的连接链序列长度为20 ‑30nt， 所述双嵌段DNA2的连接链序列长度为5 ‑8nt。 4.根据权利要求3所述的检测探针， 其特征在于， 所述端粒酶引物序列如SEQ  ID NO.3 所示。 5.根据权利要 求4所述的检测探针， 其特征在于， 所述双嵌段DNA1序列如SEQ  ID NO： 1所 示且所述双嵌段DNA2序列如SEQ  ID NO： 2所示。 6.权利要求1所述检测探针的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤(1)： 以金纳米颗粒为载体， 采用不同序列的双嵌段DNA即双嵌段DNA1和双嵌段DNA2 分别修饰AuNPs， 经修饰后获得AuNPs ‑DNA1复合物和AuNPs ‑DNA2复合物； 步骤(2)： 将端粒酶引物序列、 dNTPs、 AuNPs ‑DNA1复合物、 AuNPs ‑DNA2复合物混合孵育， 获得所述二聚体结构的检测探针。 7.根据权利要求6所述的检测探针的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中采用不同 序列的双嵌段DNA即双 嵌段DNA1和双嵌段DNA2分别修饰AuNPs具体包括： 分别用双 嵌段DNA1 和DNA2以1:100的摩尔浓度比例修饰两份等量的AuNPs， 并将其混合物在25℃混合孵育持续 24小时； 每30min添加PBS缓冲液加强AuNPs与DNA之间的连接； 添加的PBS缓冲液的终浓度为 0.1M； 然后用0.1M  PBS进行盐析， 在25℃下孵育持续24小时完成， 得到两种AuNPs ‑DNA复合 物； 将产物进行离心后重复洗涤， 将AuNPs ‑DNA复合物新悬浮在pH  7.4、 浓度为0.1M  PBS溶 液中保存。 8.一种端粒酶活性检测试剂盒， 包括权利要求1所述的检测探针。 9.一种端粒酶活性的直接检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： 步骤(1):取权利要求1 ‑5中任意一项权利要求所述检测探针， 加入端粒酶逆转录缓冲 液和反应碱基dNTP将反应物混合均匀， 加入端粒酶提取 液， 混合均匀， 在37℃条件下反应； 步骤(2)： 在反应一段 时间后， 加入十二烷基硫酸钠SDS溶液终止端粒酶的延伸反应， 在 降温后， 离心去除上清液， 使用超纯 水溶液复溶， 重复三次； 步骤(3)： 将反应产物加入纳米孔检测液池一侧， 其中纳米孔的直径与所述探针的金纳 米颗粒尺寸匹配， 施加不同偏置电压进 行信号检测， 使用膜片钳记录轨迹电流信号， 获得反 应物在不同电压下的电流脉冲信号， 通过对脉冲信号的幅值和滞留时间进 行特征提取和统 计分析可以实现对端粒酶活性的高灵敏监测。 10.根据权利要求9所述的一种端粒酶活性的直接检测方法， 其特征在于， 所述金纳米 颗粒尺寸 为5nm， 纳米孔的直径为24 nm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438171 A 2一种检测探针、 试剂盒及端粒酶活性的直接检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于端粒酶活性检测领域， 特别涉及一种检测探针、 试剂盒及端粒酶活性 的直接检测方法。 背景技术 [0002]端粒存在于染色体末端， 是一个形似 “帽子”的结构， 它会 随着正常细胞的有丝分 裂过程逐渐变短， 与细胞 的衰老和凋 亡息息相关。 而端粒酶是一种 可以维持染色体长度的 逆转录酶， 它会在染色体的末端持续的添加(TTAGGG)n碱基序列， 使端粒在 有丝分裂过程中 维持长度。 端粒酶普遍存在于人体的细胞中， 但是在大多数 的细胞中端粒酶是不具备活性 的， 除了造血细胞、 生殖细胞以及干细胞。 一旦体细胞中的端粒酶活性异常， 通常与癌肿和 肿瘤疾病的发生有关， 因此端粒酶成为癌症等疾病的重要靶标分子。 目前人们开发了多种 对端粒酶活性进行检测的方法， 希望解决癌症早期诊断和治疗方面存在的问题。 如传统的 端粒扩增法具有高的特异性， 但也有扩增错误、 耗时较长， 样品量大等问题。 最近新开发的 荧光光谱， 表面增强拉曼光谱， 电化学分析等方法新颖， 但仍存在探针易猝灭， 信号响应差 以及仪器昂贵 等局限性。 [0003]本课题组致力于纳米孔对端粒酶活性的高效检测， 力求操作的简单可行， 便于集 成化。 固态纳米孔是一种由无机材料制成的单分子 分析传感器， 与生物纳米孔相比， 固态纳 米孔具有较高的物理和化学稳定性， 表面改性能力以及独特 的机械强度和纳米精度， 大大 开拓了纳米孔传感平台在实际中的应用。 鉴于传统纳米孔传感 中， 实现酶等特异 性识别， 多 借助于纳米孔通道内分子修饰， 该方法具有一定的优势， 但修饰过程中难免引起纳米孔芯 片损坏， 同时酶的修饰效率低， 且修饰后的纳米孔用途单一。 本课题组于2021年2月申请的 公开号为CN112795565A、 名称为 “检测探针、 试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法 ”的专利 文件， 公开了一种检测探针、 试剂盒及端 粒酶活性的直接检测方法。 该发明所述的检测探针 是在金纳米球和表面覆盖的标记巯基DNA引物， 该引物以Au ‑S键连接， 实现金球表面DNA序 列的高密度覆盖。 当端粒酶加入后， 以引物为模板， 进行端粒延伸。 在端粒延伸的动力学过 程中， 不同长度的DNA覆盖在金纳米球表面。 该酶促反应的产 物在固态纳米孔中具有明显的 信号差异， 实现了固态纳米孔对端 粒酶活性的实时高灵敏监测。 上述 发明将DNA线性长度的 变化转化为DNA ‑金纳米球的复合结构在纳米孔中的体积变化， 实现了信号放大， 同时可对 端粒酶活性进行动态监测。 发明内容 [0004]为了进一步提高端粒酶活性检测的灵敏度和可靠性、 降低采用纳 米孔检测端粒酶 活性的成本， 并提供一种在检测过程中结构更加稳定可控的检测探针， 在上述公开专利 CN112795565A技术方案的基础上， 本课题组对端 粒酶活性的直接检测进行了进一步的优化 设计， 本发明以DNA自组装的金纳米二聚体为检测 探针， 其中两个金球之间的DNA连接链与 端粒酶引物序列(TP)杂交互补。 当端粒酶加入后， 以引物 为模板进 行端粒延伸， 从而引发二说　明　书 1/7 页 3 CN 114438171 A 3