(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210070633.4 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市 市南区南海路7 号 (72)发明人 李墨非　吴蒙　 (74)专利代理 机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 210 02 代理人 李颖 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) C07K 14/46(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01)A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 一种牙鲆补体成分C 3a蛋白的应用 (57)摘要 本发明涉及分子生物学领域， 具体的说是一 种牙鲆补体成分C3a(PoC3a)的应用。 牙鲆补体 C3a为序列表SEQ  ID No.1中的氨基酸序列所示。 本发明的牙鲆补体C3a蛋白能够与多种细菌结 合， 且能显著抑制牙鲆体内迟缓爱德华氏菌数量 的增加。 所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜 能。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114344450 A 2022.04.15 CN 114344450 A 1.一种牙鲆补体成分C3a的应用， 其特征在于： 牙鲆补体蛋白C3a(PoC3a)在制备抑菌剂 中的应用。 2.按权利 要求1所述的补体成分C3a的应用， 其特征在于： 所述补体成分C3a在制备迟缓 爱德华氏菌抑菌剂中的应用。 3.按权利要求2所述的补体成分C3a的应用， 其特征在于： 所述补体成分C3a(PoC3a)为 序列表SEQ  ID No.1中氨基酸序列所示。 4.按权利 要求1‑3任意一项所述的补体成分C3a的应用， 其特征在于： 所述补体成分C3a 的构建为以牙鲆cDNA为模板， 用引物F1和R1进行PCR扩增， PCR产物连接表达载体后得到重 组质粒， 将其转化至BL21(DE3)， 而后纯化即得含序列表SEQ  ID No.1所示的补体成分C3a蛋 白； 所述引物F1和R 1分别为： F1， 5’ ‑GGATCCATGGCTACCACTGTAATGAACGTC‑3； R1， 5’ ‑CTCGAGTCACT TGTCATCATCGTCT TTGTAATCGCGAGC CAAGTCGAGCTGAT ‑3’。 5.按权利要求 4所述的补体成分C 3a的应用， 其特 征在于： 1)表达载体pEtPoC 3a‑sumo的构建 以牙鲆cDNA为模板， 用引物F1和R1进行PCR扩增， PCR产物纯化后与质粒T ‑Simple进行 连接， 连接 混合液转化大肠杆菌后在含卡那霉素的LB培养基上培养8 ‑12h， 筛选转化子提取 质粒， 得重组质粒； 将重组质粒用BamH1和Xho1酶切， 回收目的片段， 连接于pET28a ‑sumo， 连 接液转化入大肠杆菌， 在含卡那霉素的LB培养基上培养18 ‑24小时， 筛选转化子提取质粒， 即为表达载体pEtPoC 3a‑sumo； 2)补体成分C 3a的制备 将上述步骤1)的质粒pEtPoC3a ‑sumo转化B L21(DE3)， 在含有卡那霉素的LB培养基上培 养， 筛选转化子即为BL21/pEtPoC3 a‑sumo； 经异丙基 ‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后， 利 用亲和层析柱纯化重组蛋白， 并用Sumo蛋白酶去除Sumo标签后， 即为含序列表SEQ  ID No.1 所示的补体成分C 3a蛋白。 6.一种构建补体成分C3a的引物对， 其特征在于： 构 建牙鲆补体成分C3a(PoC3a)的引物 对为所述引物F1和R 1分别为： F1， 5’ ‑GGATCCATGGCTACCACTGTAATGAACGTC‑3； R1， 5’ ‑CTCGAGTCACT TGTCATCATCGTCT TTGTAATCGCGAGC CAAGTCGAGCTGAT ‑3’。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114344450 A 2一种牙鲆补体成分C3a蛋白的应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学 领域， 具体的说是一种牙鲆补体成分C 3a(PoC3a)的应用。 背景技术 [0002]补体系统大约由30多种， 包括固有成分、 调节因子和补 体受体在内的蛋白质组成。 这个复杂而精密的防御系统在机体的固有免疫与适应性免疫反应中发挥着重要的作用。 补 体系统可以由多种途径激活发挥作用， 其中经典途径， 旁路途径和凝集素途径是补体激活 的3种途径。 补体系统通过三条途径激活后均生成C3转移酶， 进一步切割C3， 生成C3a和C3b 等具有重要生物学活性的小片段。 C3a是一种重要的免疫小分子， C3a可以诱导嗜酸性粒细 胞和肥大细胞的趋化反应， 并促进免疫反应中的炎症反应。 补体成分C3a已在 多种鱼类中发 现， 但是， 在牙鲆中其功能和应用性研究尚十分缺乏。 发明内容 [0003]本发明目的在于提供一种牙鲆补体成分C 3a(PoC3a)的应用。 [0004]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案为： [0005]一种补体成分C 3a的应用， 牙鲆补体成分C 3a(PoC3a)在制备抑菌剂中的应用。 [0006]所述补体成分C 3a在制备迟缓爱德华氏菌抑菌剂中的应用。 [0007]所述补体成分C 3a(PoC3a)为序列表SEQ  ID No.1中氨基酸序列所示。 [0008]所述补体 成分C3a的构建为以牙鲆cDNA为模板， 用引物 F1和R1进行PCR扩增， PCR产 物连接表达载体后得到重组质粒， 将其转化至BL21(DE3)， 而后纯化即得含序列表SEQ  ID  No.1所示的补体成分C 3a蛋白； [0009]所述引物F1和R 1分别为： [0010]F1， 5’ ‑GGATCCATGGCTACCACTGTAATGAACGTC‑3； [0011]R1， 5’ ‑CTCGAGTCACT TGTCATCATCGTCT TTGTAATCGCGAGC CAAGTCGAGCTGAT ‑3’。 [0012]进一步的说： [0013]1)表达载体pEtPoC 3a‑sumo的构建 [0014]以牙鲆cDNA为模板， 用引物F1和R1进行PCR扩增， PCR产物纯化后与质粒T ‑Simple 进行连接， 连接 混合液转化大肠杆菌后在 含卡那霉素的LB培养基上培养8 ‑12h， 筛选转化子 提取质粒， 得重组质 粒； 将重组质粒用BamH1和Xho1酶切， 回收目的片段， 连接于pET28a ‑ sumo， 连接液转化入大肠杆菌， 在含卡那霉素的LB培养基上培养18 ‑24小时， 筛选转化子提 取质粒， 即为表达载体pEtPoC 3a‑sumo； [0015]2)补体成分C 3a的制备 [0016]将上述步骤1)的质粒pEtPoC3a ‑sumo转化BL21(D E3)， 在含有卡那霉素的LB培养基 上培养， 筛选转化子即为BL21/pEtPoC3a ‑sumo； 经异丙基 ‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导 后， 利用亲和层析柱纯化重组蛋白， 并用Sumo蛋白酶去除Sumo标签后， 即为含序列表SEQ  ID  No.1所示的补体成分C 3a蛋白。说　明　书 1/4 页 3 CN 114344450 A 3