(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210071013.2 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 锡林郭勒职业学院 地址 026000 内蒙古自治区锡林郭勒盟锡 林浩特市明安图街1 1号 (72)发明人 郭梁　刘国强　罗建兴　徐伟良　 李春冬　 (74)专利代理 机构 成都方圆聿联专利代理事务 所(普通合伙) 51241 代理人 邓永红 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 乳肉中牛、 水牛、 牦牛以及质控同步检测的 引物和探 针 (57)摘要 本发明公开了一种乳肉中牛、 水牛、 牦牛及 质控同步检测的引物和探针， 引物和探针序列如 下： 两源性检测正向引物序列如SEQ  ID No.1所 示； 两源性检测 反向引物序列如SEQ  ID No.2所 示； 牛探针序列如SEQ  ID No.3所示； 水牛探针序 列如SEQ ID No.4所示； 牦牛探针序列如SEQ  ID  No.5所示； 质控探针序列如SEQ  ID No.6所示。 本 发明的引物、 探针的特异性好、 灵敏度高， 可以实 现乳肉中牛、 水牛以及牦牛源性以及质控同管检 测， 并且可以进行牛源性、 水牛源性以及牦牛源 性的定量检测。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图12页 CN 114350822 A 2022.04.15 CN 114350822 A 1.乳肉中牛、 水牛、 牦牛以及质控 同管检测的引物和探针， 其特征在于， 引物和探针序 列如下： 两源性检测正向引物序列如SEQ  ID No.1所示， 两源性检测反向引物序列如SEQ  ID No.2所示， 牛探针序列如SEQ  ID No.3所示， 水牛探针序列如SEQ  ID No.4所示， 牦牛探针序列如SEQ  ID No.5所示， 质控探针序列如SEQ  ID No.6所示。 2.根据权利要求1所述的乳肉中牛源性、 水牛源性、 牦牛源性以及质控同管检测的引物 和探针， 其特征在于， 牛探针、 水牛探针、 牦牛源性和质控探针序列的5'端修饰有报告基团， 3'端修饰有淬灭基团， 报告基团为FAM、 HEX、 ROX或CY5中的任意一种， 淬灭基团为TAMRA、 MGB、 BHQ1或BHQ2中任意 一种。 3.乳肉中牛源性、 水牛源性、 牦牛源性以及质控 同管检测的方法， 其特征在于， 步骤如 下： (1)提取乳肉的DNA； (2)检测DNA的浓度和质量， 并将浓度稀释至10 0‑200ng/ μL； (3)利用SEQ  ID No.1～SEQ  ID No.6的引物和探针对DNA稀释 液进行多重荧光定量PCR 扩增， 以牛、 水牛和牦牛阳性标准品做阳性对照， 以灭菌的去离子水做阴性对照， 以DNA提取 的空白对照做提取 方法的对照组； (4)Real‑time PCR反应结束后， 设置Threshold为自动， 读取牛、 水牛、 牦牛和质控相应 探针的Ct值以及阳性对照、 阴性对照和空白对照的Ct； 只有当质控Ct≤40和阳性对照Ct≤ 40， 阴性对照和空白对照Ct为0时才 可以进行相应探针源性结果的判定； 当相应探针的Ct≤ 40， 结果判定为具有相应源性， 同时有 多个探针的Ct≤40， 结果判定为具有相应多源性； (5)利用牛、 水 牛和牦牛 阳性标准品做DNA定量的标准曲线； (6)利用乳肉中的相应源性的Ct值和标准曲线中的公式可以得到乳肉中相应源性的定 量检测结果。 4.根据权利要求3所述的乳肉中牛源性、 水牛源性、 牦牛源性以及质控同管检测的方 法， 其特征在于， Real ‑time PCR扩增参数为： 预变性温度94℃， 30s， 变性温度94℃， 5s， 退火 延伸温度6 0℃， 31s， 40个 循环。 5.根据权利要求3所述的乳肉中牛源性、 水牛源性、 牦牛源性以及质控同管检测的方 法， 其特征在于， Real ‑time PCR反应体系为： Probe  qPCR预混液10 μL、 SEQ  ID No.1所示的 两源性检测正向引物1μL， 浓度为10 μmol/L； SEQ  ID No.2所示的两源性检测反向引物1μL， 浓度为10 μmol/L； SEQ  ID No.3所示的牛探针0.5 μL， 浓度为10 μmol/L； SEQ  ID No.4所示的 水牛探针0.5μL， 浓度为10μmol/L； SEQ  ID No.5所示 的牦牛探针0.5μL， 浓度为10μmol/L； SEQ ID No.6所示的质控探针0.5 μL， 浓度为10 μmol/L； DNA模板2 μL， 灭菌的去离子水4.5 μL， 总体积20 μL。 6.一种检测试剂盒， 含有SEQ  ID No.1～SEQ ID No.6所示的引物和探针。 7.根据权利要求6所示的试剂盒， 其特征在于， 所示试剂盒还包括Probe  qPCR预混液、 标准品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350822 A 2乳肉中牛、 水牛、 牦牛以及质控同步检测的引物和探针 技术领域 [0001]本发明属于食品检测技 术领域， 尤其涉及乳肉中动物源性检测领域。 背景技术 [0002]牛、 水牛和牦牛是三种与人们生活紧密联系牛属动 物， 由于它们的线粒体D NA高度 相似， 给检测带来 一定困难。 [0003]CN 112481391A公开了黄牛、 水牛和牦牛 的实时荧光PCR检测试剂和检测方法， 该 发明中， 分别设计了三对检测引物和相应探针， 可实现单重、 双重和三重实时荧光检测。 单 重检测时， 3种牛的检测灵敏度均为0.25ng/ul， 双重检测时， 黄牛的检测灵敏度降低至 0.1ng/ul， 三重检测时， 黄牛和水牛的检测灵敏度可达0.1ng/ul， 而牦牛的灵敏度仍可达 0.025ng/ul。 [0004]CN107858 442A公开了一种牛肉食品中牦牛、 黄牛及水牛三种源性成分的检测引物 及方法， 采用一对通用引物实现了三种源性的同时检测， 不需要检测探针， 其DNA溶液浓度 检测灵敏度为0.01ng/ul， 质量分数检出低限灵敏度为0.01％。 [0005]目前， 牛乳、 牛肉中牛、 水牛和牦牛源性真伪鉴别相关的技术研究、 检测标准、 发明 专利以及商业试剂盒主要集中在目标源性 成分的检测。 然而， 所有基于P CR技术的检测标准 都需要阳性质控， 阳性质控是判断PCR反应是否有效进行的前提指标。 已有的牛、 水牛和牦 牛源性检测方法的质控都是建立在以阳性样品为基础的异管质控。 假阴性一直是困扰PCR 技术在乳肉真伪鉴别中广泛应用的瓶颈， 相比异管质控， 同管质控是去除假阴性的更为有 效手段。 发明内容 [0006]本发明所要解决的技术问题为： 如何提供一种高效且特异性强的乳肉中牛源性、 水牛源性、 牦牛源性以及质控同管检测的引物、 探针及试剂盒和方法， 解决乳肉中牛、 水牛 以及牦牛源性成分定性和定量检测问题。 [0007]本发明的技术方案为： 乳肉中牛源性、 水牛源性、 牦牛源性以及质控同管检测的引 物和探针， 引物和探针序列如下： [0008]两源性检测正向引物序列如SEQ  ID No.1所示； [0009]两源性检测反向引物序列如SEQ  ID No.2所示； [0010]牛探针序列如SEQ  ID No.3所示； [0011]水牛探针序列如SEQ  ID No.4所示； [0012]牦牛探针序列如SEQ  ID No.5所示； [0013]质控探针序列如SEQ  ID No.6所示。 [0014]进一步地， 牛探针、 水牛探针、 牦牛探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团， 3'端修饰有淬灭基团， 报告基团为FAM、 HEX、 ROX或CY5中的任意一种， 淬灭基团为TAMRA、 MGB、 BHQ1或BHQ2中任意 一种。说　明　书 1/11 页 3 CN 114350822 A 3