(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210074694.8 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 安徽省农业科 学院植物保护与农产 品质量安全研究所 地址 230031 安徽省合肥市农科南路40号 (72)发明人 徐会永　潘锐　杨雪　臧昊昱　 谷春艳　戚仁德　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 代理人 高宁馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种用于扩增菠萝泛菌的特异性引物及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于扩增菠萝泛菌的特 异性引物及其应用， 属于分子检测技术领域。 用 于扩增菠萝泛菌的特异性引物， 所述的特异性引 物的上游引 物序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述的 特异性引物的下游引物序列如SEQ  ID NO.2所 示。 应用方法如下： 提取待测样品的DNA作为模 板， 利用特异性引物进行PCR反应， 取PCR反应扩 增产物进行检测， 若存在分子量为182  bp的DNA 条带， 则证明所述的待检测样品中含有菠萝泛 菌。 本发明的应用方法具有 准确、 快速、 简单易操 作等优点， 可 以在病害侵染初期鉴定出病原物； 可用于田间调查和植物产品的检测， 对控制由菠 萝泛菌引起的多种细菌病害的大面积爆发和跨 区域传播具有重要意义， 本发明体系的建立也为 其他病原物的检测提供技 术指导和理论支持。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114350828 A 2022.04.15 CN 114350828 A 1.一种用于扩增菠 萝泛菌的特异性引物， 其特 征在于： 所述的特异性引物的上游引物序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述的特异性引物的下游引物序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种如权利要求1所述的特异性引物在菠 萝泛菌检测中的应用。 3.根据权利要求2所述的特异性引物在菠 萝泛菌检测中的应用， 其特 征在于： 提取待测样品的DNA作为模板， 利用权利要求1中特异性引 物进行PCR反应， 取PCR反应 扩增产物进行检测， 若存在分子量为182  bp的DNA条带， 则证明所述的待检测样品中含有 菠 萝泛菌。 4.根据权利要求2所述的特异性引物在菠 萝泛菌检测中的应用， 其特 征在于： 所述的PCR反应的扩增体系如下： 10×PCR buffer            2.5 μL， 25mM MgCl2                1.5 μL， 25mM dNTP                 1 μL， 20 μM 上游引物              0.5 μL， 20 μM 下游引物              0.5 μL， 5 U/ μL Taq DNA聚合酶       0.5 μL， 模板DNA                   1 μL， ddH2O                     17.5 μL。 5.根据权利要求2所述的特异性引物在菠 萝泛菌检测中的应用， 其特 征在于： 所述的PCR反应的反应程序如下： 94℃变性3  min； 进入循环， 94℃变性30  s， 58℃退火30  s， 72℃延伸30  s， 35个循环； 最 后72℃延伸5  min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350828 A 2一种用于扩增菠萝泛菌的特异性引物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子检测技术领域， 具体地说， 涉及一种用于扩增菠萝泛菌的特异性 引物及其应用。 背景技术 [0002]菠萝泛菌 （ Pantoea ananatis ） 可引起水稻茎腐叶枯病、 玉米细菌性褐腐病、 多肉 植物细菌褐腐病、 柑橘枯萎病、 大白菜干烧心病、 生姜细菌性黄叶斑病等多种细菌性病害， 近年来在我国辽宁、 吉林、 浙江、 广东、 安徽、 河北等多个省份均有发生， 其侵染性 强、 致病率 高、 危害性大， 造成作物严重减产。 目前可通过对样品 （叶片、 种子、 茎秆等） 进行致病菌分 离、 对菌株进行DNA提取并使用16s  rDNA通用引物进行测序， 明确致病菌的种类。 但此方法 耗时长、 特异性低、 对技 术人员要求高， 难以快速准确检测该病原菌 。 [0003]现有技术的情况如下， 如中国发明专利， 申请号： CN201810205789.2， 公开号： CN108342498A， 公开了一种菠 萝泛菌的PCR检测方法， 其 技术内容如下： “一种菠萝泛菌的PCR检测方法， 以菠萝泛菌的基因组DNA作为PCR反应模板进行 PCR反应； PCR反应体系为： 10 ×PCR Buffer 2.5μL； 10mM  dNTP 1.0μL； 10mM上游引物 PanITS2‑1F 1.0 μL； 10mM 下游引物PanITS2 ‑1R 1.0 μL； 模板DNA  1.0 μL； 2.5U/mL  Taq酶0.5 μ L； ddH2O 18.0 μL； 反应条件为： 94℃预变性3  min， 94℃变性30  s， 50℃退火15  s， 72℃延伸 25 s， 25个循环； 所述上游引物PanITS2 ‑1F为： 5’ ‑TCGCCTGATTATACAATCTCACCTTCA ‑3’； 所述 下游引物PanITS2 ‑1R为： 5’ ‑GTGGGTTGTGAGGTTAAGCGACTAA ‑3’。 本发明是根据菠萝泛菌 Pantoea ananatis 的ITS rDNA序列中的一条53 7 bp的序列， 设计了该菌株的特异性引物对 PanITS2‑1F/PanITS2 ‑1R， 该引物可以将菠萝泛菌与其他植物病原细菌区分开， 基于该引物 开发的PCR检测方法可以用于菠萝泛菌的快速检测， 该方法能够快速特异准确的检测到植 株材料中的菠萝泛菌， 为玉米细菌斑点病的早期诊断、 检疫和病害的早期预警提供了一种 方法， 也可为该菌株在其 他环境中的快速检测提供一种方法 ”。 [0004]又如中国发明专利， 申请号： CN20191044 1478.0， 公开号： CN110184365B， 公开了一 组桑树细菌性 枯萎病病原菠萝泛菌的PCR检测引物及应用， 其 技术内容如下： “一组菠萝泛菌的PCR检测引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1～2所示。 [0005]tagtactgca ggatgccgtccca(SEQ ID NO： 1)； ggcgttgtcactg gtgatgacgt(SEQ  ID NO： 2)。 [0006]进一步本发明要求保护以上所述PCR检测引物在菠萝泛菌和/或桑树细菌性枯萎 病的检测中的应用。 同时本发 明要求保护以上所述P CR检测引物在制备菠萝泛菌和/或桑树 细菌性枯萎病的检测试剂盒中的应用。 本发明还要求保护一种 菠萝泛菌的检测试剂盒， 包 括以上所述检测引物。 优选地， 还包括PCR反应的试剂。 优选地， 所述PCR反应的试剂为2 × Taq Master Mix。 优选地， 还包括ddH2O。 更优选地， 所述检测试剂盒， PCR反应的体系为2 × Taq Master Mix 10 μL， 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1～2所示引物(10 μM)各0.5 μL， 待测 样本 DNA 2 μL， ddH2O补足25 μL。 优选地， 所述检测试剂盒， PCR反应的程序为： 94℃预变性4  min；说　明　书 1/6 页 3 CN 114350828 A 3