(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210072688.9 (22)申请日 2022.01.21 (71)申请人 国科宁波生命与健康产业研究院 地址 315016 浙江省宁波市北郊路159号 申请人 中国科学院大学宁波华美医院 (72)发明人 毛瑞　缪青　蔡挺　吴欣瑶　 (74)专利代理 机构 上海硕力知识产权代理事务 所(普通合伙) 31251 代理人 王法男 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、 试剂 盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种基于闭合颈环介导的核酸 恒温扩增技术(Closed  Dumbbell  mediated   Isothermal  Amplification  of nucleic   acids， CDA)的副溶血性弧菌快速检测技术。 本发 明公开了一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、 试剂盒及其应用。 所述CDA引物组为针对副溶血 性弧菌的保守区片段扩增的引物组， 为引物对 VP‑F2/VP‑R2和引物对VP ‑MF/VP‑MR； 其中， VP ‑F2 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， VP ‑R2的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.2所示； VP ‑MF的核苷酸序列 如SEQ ID NO.3所示， VP ‑MR的核苷酸序列如SEQ   ID NO.4所示。 本发明提供的方法或可视化试剂 盒无需昂贵的仪器、 也无需复杂的操作即可完成 对副溶血性弧菌的快速准确检测， 因此， 适用于 专业程度不高的机场、 海关、 口岸、 社区等地的现 场快速检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114350827 A 2022.04.15 CN 114350827 A 1.一种非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌的CDA引物组， 其特征在于： 所述CDA引物 组为以下两对引物， 引物对VP ‑F2/VP‑R2， 其中， VP ‑F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， VP ‑R2的核苷酸序 列如SEQ ID NO.2所示； 引物对VP ‑MF/VP‑MR， 其中， VP ‑MF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， VP ‑MR的核苷酸序 列如SEQ ID NO.4所示。 2.一种检测副溶血性弧菌的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括权利要求1所述的 CDA引物组。 3.如权利要求2所述的一种检测副溶血性弧菌的试剂盒， 其特征在于： 所述CDA引物组 中， 引物VP‑F2与VP‑R2的浓度均为0.2 ～0.4 μM， 引物 VP‑MF与VP‑MR的浓度均为1～ 2 μM。 4.如权利要求2所述的一种检测副溶血性弧菌的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还包 括Bst聚合酶、 CDA反应缓冲液、 超纯 水以及显色剂。 5.如权利要求4所述的一种检测副溶血性弧菌的试剂 盒， 其特征在于： 所述显色剂选自 SYBR green I、 Eva green、 羟基萘酚蓝、 铬黑T中的一种。 6.如权利要求4所述的一种检测副溶血性弧菌的试剂盒， 其特征在于： 所述CDA反应缓 冲液包括： Tris ‑HCl、 KCl、 (NH4)2SO4、 MgSO4和Triton X‑100。 7.如权利要求2所述的一种检测副溶血性弧菌的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒反应 体系的组成为： 2‑50mM Tris‑HCl pH8.8 2‑20mM KCl 2‑20mM(NH4)2SO4 2～20mM MgSO4 0.1～0.5％Trito nX‑100 0.2～1M甜菜碱 1～1.6mM  dNTP 5～10U Bst DNA聚合酶 100～150 μmol/L显色剂 0.2～0.4 μM引物 VP‑F2 0.2～0.4 μM引物 VP‑R2 1～2 μM引物VP‑MF 1～2 μM引物VP‑MR； 反应溶剂为超纯 水。 8.权利要求7所述的试剂盒非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌的方法， 包括以下步 骤： 步骤1： 将待检测核酸样本和试剂盒的反应 体系混合， 制备扩增反应液； 步骤2： 上述制备得到的扩增反应液， 于60～65℃反应20～80min， 根据显色结果判断样 品中是否含有副溶 血性弧菌 。 9.权利要求1所述的CDA引物组在非疾病诊断目的 的副溶血性弧菌检测中的应用。 10.权利要求2 ‑7任一项所述的 试剂盒在非疾病诊断目的的副溶血性弧菌检测中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350827 A 2一种检测副溶 血性弧菌的C DA引物组、 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、 试 剂盒及其应用。 背景技术 [0002]副溶血性弧菌是一种嗜盐生长的革兰氏阴性多形态球杆菌， 广泛存在于海洋环境 中。 其菌体呈弧状、 杆状、 或丝状， 无芽孢且 无荚膜。 此菌含有细胞色素氧化酶， 不分解蔗糖， 但能在不产气及不产生硫化氢的情况下分解葡萄糖而产酸等生化特性。 由于副溶血性弧菌 为一嗜盐性细菌， 必须在含盐0.5％～8 ％的环境中方可生长， 且以含盐量在2％～4％的情 况下最佳。 副溶血性弧菌能够在温度为5～44℃范围内生长， 但以30～35℃为最佳， 当温度 低40℃时则停止生长； 适宜生长的pH为7.5～8.5， 以pH7.7为最佳， 在pH低于6的酸性条件下 则生长不佳。 [0003]副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌， 主要来源于鱼、 虾、 蟹、 贝类和海藻等 海产品。 人们食用被副溶血性弧菌污染的食物后极可能会引起以腹痛、 腹泻、 恶心、 呕吐、 发 热等为主要症状的急性肠胃炎。 其特征之一为中毒者的粪便多呈水样， 且常混有粘液或脓 血。 此外， 重症患者还可出现脱 水、 休克昏迷， 甚至死亡的症状， 故副溶血性弧菌又有肠炎弧 菌之称。 由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道， 因此， 针对食物中的副溶血性弧 菌进行定性或定量检测非常重要。 [0004]现有的检测方法主要包括PCR、 DNA探针技术等。 尽管这些技术能快速检测样品中 总的或致病性副溶血性弧菌的数量， 但这些方法依赖于特殊而昂贵的设备， 且其操作过程 复杂费时(包括DNA的分离、 杂交、 比色以及探针和引物的合成等)， 只有熟练掌握了其操作 技巧的技术人员才能完成测试。 因此， 以上方法并不适用于现场快速检测， 建立一种快速、 灵敏、 特异的副溶 血性弧菌检测方法迫在眉睫。 [0005]基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed  Dumbbell  mediated   Isothermal Amplification  ofnucleic  acids， CDA)是国科宁波 生命与健康产业研究院开 发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国专利申请号： 202110473121.8)。 该方法主要利用2 种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域， 在恒温条件进行扩增反应。 与常规基因检测 手段(如PCR等)相比， CDA反应在恒温水浴箱 中便可完成， 仪器设备要求低， 较传统PCR和培 养法操作简单许多， 不需要专业人士也可准确完成， 且扩增结果可结合金属离子指示剂羟 基萘酚兰(HNB)， 通过肉 眼观察颜色变化以实现对结果的判断， 使其适用于基层医疗机构及 地方检验检疫部门。 并且， CDA还 可以大大缩短操作时间， 减少样品污染机会， 适合应用于副 溶血性弧菌的快速诊断。 此外， CDA所用关键成环引物约为30bp， 较LAMP中成环引物 40bp短， 这将极大程度的节约成本 。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、 试剂盒及其应用。 解决说　明　书 1/7 页 3 CN 114350827 A 3