(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210069710.4 (22)申请日 2022.01.21 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114292852 A (43)申请公布日 2022.04.08 (73)专利权人 中国农业科 学院作物科 学研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 杨平　阚金红　蔡羽　程春园　 蒋枞璁　金彦龙　 (74)专利代理 机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 1 1246 专利代理师 刘妮 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01)(56)对比文件 CN 103233006 A,2013.08.07 CN 1094683 30 A,2019.0 3.15 Jinhong Kan等.Simultaneous editi ng of host factor gene TaP DIL5-1 homoeoal leles confers wheat yel low mosaic virus resistance i n hexapl oid wheat. 《New Phytologist》 .202 2,第234卷(第2期), 董槿等.抗小麦 黄花叶病毒转基因小麦的获 得及病毒诱 导的基因沉默. 《科 学通报》 .20 02, (第10期), 李建波等.大麦 黄花叶病抗 性遗传与育种研 究进展. 《麦类作物学报》 .2015,(第0 3期), Elisa d"Aloisio等.The protei n disulfide isomerase gene fami ly in bread wheat (T. aestiv um L.). 《BM C Plant Biology》 .2010,第10卷 时丽洁 等.大麦蛋白质二硫键异构酶基因 家族的鉴定与表达分析. 《作物学报》 .2019,第45 卷(第9期), 审查员 王小玉 (54)发明名称 一种小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组 合物 (57)摘要 本发明公开了一种小麦黄花叶病抗病材料 创制的标记组合物， 利用CRISPR/Cas9基因编辑 手段， 通过对小麦黄花 叶病感病品种 “Fielder” 中TaPDIL5 ‑1目标基因靶序列进行编辑， 随后通 过杂交和分子标记辅助选择， 获得了同时编辑 TaPDIL5‑1基因A， B， D三个亚基因组上3个拷贝的 4个纯合株系， 接种小麦黄花叶病毒后发现， 这些 株系对小麦黄花叶病具有抗病性， 而编辑1个或 者2个拷贝的纯合株系对小麦黄花叶病依然感 病， 证明TaPDIL5 ‑1基因是小麦黄花叶病的感病 因子， 通过编辑或者敲除小麦A， B， D三个亚基因组上的3个拷贝， 可 以创制抗小麦黄花叶病的小 麦材料。 权利要求书1页 说明书8页 序列表6页 附图3页 CN 114292852 B 2022.11.01 CN 114292852 B 1.一种小麦黄花叶病抗病材料的创制方法， 其特征在于： 利用CRISPR/Cas9基因编辑技 术实现对TaPDIL5 ‑1基因编辑， 其中TaPDIL5 ‑1基因编辑的sgRNA靶标序列的核苷酸序列为 SED ID NO.1； 小麦黄花叶病抗病基因 TaPDIL5‑1的核苷酸序列为SED  ID NO.12或SED  ID  NO.13或SED  ID NO.14。 2.根据权利要求1所述的一种 小麦黄花叶病抗病材料的创制方法， 其特征在于： 基于两 轮PCR扩增得到的DNA分子， 随后采用限制性内切酶酶切PCR扩增产物和 凝胶电泳检测来鉴 定基因编辑后的小麦 黄花叶病抗病材 料， 具体步骤如下： 步骤一： 利用CTAB法提取基因编辑后的小麦基因 组DNA； 步骤二： 利用小麦基因组DNA为模板， 利用A、 B、 D三个亚基因组上特异的引物组合物分 别进行PCR扩增， 获得三个染色体组上特异的DNA分子， A染色体上所述的引物组合物为SED   ID NO.2和SED  ID NO.3； B染色体 上的引物组合物为： SED  ID NO.4和SED  ID NO.5； D染色体 上的引物组合物为SED  ID NO.6和SED  ID NO.7； 步骤三： 分别以步骤二中所示的染色体上的引物 组合扩增的DNA分子为模板， 以如下引 物组合物进行扩增， 并对扩增得到的DNA分子进行酶切， 其中4bp缺失所用引物组合对为: SED ID NO.8和SED  ID NO.9， 限制性内切酶为 Ava II； 3bp缺失所用 引物组合对为SED  ID NO.10和SED  ID NO.9， 限制性内切酶为 Hinf I； 2bp 缺失所用引物组合对为： SED  ID NO.11和SED ID NO.9， 限制性内切酶为 Bts I； 步骤四： 以步骤三中扩增得到的DNA分子进行相应的酶切鉴定， 其中不能酶切的代表野 生型， 能酶切代表基因编辑后得到的突变体， 只有同时编辑小麦A、 B、 D三个亚基因组上 TaPDIL5‑1基因的纯合株系为 抗小麦花黄叶病的基因编辑材 料； 步骤五： 以步骤四中鉴定获得小麦基因编辑材料， 在人工气候培养箱条件下对播种14 天后的小麦幼苗摩 擦接种小麦黄花叶病毒， 接种后5周收取样品提取RNA， 并反转 获得cDNA， 以引物组合物SED  ID NO.15和SED  ID NO.16对病毒的cDNA样品进行扩增， 定性检测WYMV的 积累； 以引物组合物SED  ID NO.17和SED  ID NO.18对病 毒的cDNA样品进行扩增， 通过qPCR 相对定量检测WYMV的积累； 以引物组合物为SED  ID NO.19和SED  ID NO.20对cDNA样品进行 扩增， 作为病毒定量检测的内参基因。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114292852 B 2一种小麦黄花叶病抗病材料创制的标记组合物 技术领域 [0001]本发明涉及一种小麦黄花叶病抗病基因， 具体涉及小麦黄花叶病隐性抗病基因 TaPDIL5‑1的鉴定方法和应用。 背景技术 [0002]小麦(Trit icum avesticum L.)黄花叶病是一种由小麦黄花叶病毒(Wheatyellow   mosaic virus,WYMV)感染引起的土传病毒病害， 严重威胁我国小麦粮食生产安全。 WYMV属 于马铃薯Y病毒科的大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)， 是我国冬小麦种植区包括黄淮、 长江 中下游地区的重要病害之一。 近年来， 由于全球气候变 暖使得介质真菌适宜生存的区域增 加， 加上大型农机具 的推广和跨区域作业使得病原迅速蔓延， 在我国该病害有不断加重蔓 延的趋势。 根据发病程度和发病时间的不同， 小麦黄花叶病可导致小麦30％ ‑70％的产量损 失。 [0003]在自然条件下， WYMV寄生在土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxa  graminis)的休眠孢 子中， 由于土壤耕种、 风吹土壤颗粒、 含有游动孢子的水分短距离运输， 病毒随真菌孢子的 传播完成在不同植株和不同地域之间的传播过程。 通常WYMV在秋季感染幼苗根部， 次年早 春最先在小麦新叶中出现花叶病症即褪绿色斑， 随着病斑不断增多导致叶片黄化， 严重时 植株矮小、 分蘖严重减少、 植株发育迟缓， 早枯或不抽穗结实。 由于禾谷多黏菌休眠孢子在 土壤中能够存活10年以上， 在外界环境适宜的情况下， 携带病毒的休眠孢子萌发会再次感 染寄主植物， 因而该病成为一种长期、 持久的病害胁迫。 使用抗病毒基因培育抗病品种， 是 防治小麦黄花叶病最 为经济有效的手段。 [0004]植物RNA病毒通常只编码少 数几个蛋白， 其需要依赖植物编码的宿主因子实现在 宿主体内的复制和增殖。 宿主因子的功 能丧失或者改变会导致病毒无法侵染宿主植物， 由 此引起的抗病性称为隐性抗病性。 据报道， 在作物中近50％的病毒抗病基因为隐性遗传。 在 多倍体物种中， 每个宿主因子存在多个来源于不同染色体组的功能高度相似的同源基因， 这些基因间的功能冗余， 会掩盖单个或者部分 同源基因变异引起的抗病遗传 效应， 使得多 倍体中发掘隐性 抗病毒基因极为困难。 [0005]在六倍体小麦中， 目前发现的9个抗小麦黄花叶病遗传位点， 均表现为显性遗传， 尚无抗小麦黄花叶病 基因被克隆。 在二倍体大麦(Hordeum  vulgare L.)中， 二硫键异构酶 基因HvPDIL5 ‑1的功能丢失， 使得大麦对大麦黄花叶病毒属的大麦黄花叶病毒 (Barleyyellow  mosaic virus,BaYMV)和大麦温和花叶病毒(Barley  mildmosaic  virus, BaMMV)具有抗病性。 因此， 解决这 一类的问题显得 尤为重要。 发明内容 [0006]针对上述问题， 本 发明提供了小麦基因TaPD IL5‑1的基因序列、 基因编辑靶标位点 序列、 引物组合序列和鉴定方法、 以及应用示例， 可以创制并获得抗小麦黄花叶病毒的小麦 材料， 可用于小麦 黄花叶病抗病育种。说　明　书 1/8