(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210104808.9 (22)申请日 2022.01.22 (71)申请人 河南省肿瘤医院 地址 450000 河南省郑州市金 水区东明路 127号 (72)发明人 孙瑞　王志中　马杰　赵九洲　 郭永军　冯君楠　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 25/20(2019.01) G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 基于NanoString平台用于检测肺癌基因融 合的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于NanoString平台用 于检测肺癌基因融合的检测方法， 该方法包括： 1、 基因融合信息收集和管家 基因确定； 2、 探针设 计； 3、 建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定； 它收集了目前肺癌靶向治疗相关的大部分融合 类型， 并确定了每个基因融合断点处的上下游序 列， 以及基于 element方法设计探针。 与其他基于 NanoString平台检测的肺癌相关融合更加全 面， 尤其是在MET和NTRK1/2/3这四个基因的融合方 面； 通过检测ROS1基因5 ’和3’端是否不平 衡的方 式检测是否发生融合一直是一个难题， 检测灵敏 度很低且阈值很难判定， 我们重新优化了算法并 确定了新的阳性判断标准。 权利要求书2页 说明书9页 CN 114410791 A 2022.04.29 CN 114410791 A 1.基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的检测方法， 所述方法的具体步骤如 下： (1)基因融合信息收集和管家基因确定 以NCCN非小细胞肺癌诊疗指南(2020.v2)推荐检测的融合为基本指导， 确定收集ALK、 RET、 MET、 ROS1、 NTRK 1/2/3的融合信息； 在COSMIC数据库中通过检索这七个基因在 肺癌中的 融合， 再收集它们在5 ’端和3’端的具体断点信息， 最后根据每个基因的转录本信息确定基 因融合断点处的上下游序列， 确定ALK、 RET、 ROS1的常见断点处， 并获取上游和下游序列； 选 择在肺癌中具有不同表达量的四个管家基因GAP DH、 OAZ1、 POLR2 A、 GUSB用作质控和标准 化； (2)探针设计 依据每个融合亚型断点处的上下游序列分别设计探针A、 探针B和保护探针， 并在ALK、 RET、 ROS1常见断点处 的上游和下游分别设计四段探针(5p ‑1、 5p‑2、 5p‑3、 5p‑4和3p‑1、 3p‑ 2、 3p‑3、 3p‑4)， 包括探针A和探针B， 在四个管家基因GAPDH、 OAZ1、 POLR2A、 GUSB的保守区设 计探针， 包括探针A和探针B； (3)建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定， 其具体步骤如下： 1)收集经RNA ‑based  NGS验证为ALK、 RET、 ROS1、 MET、 NTRK1/2/3融合阳性和阴性的肺腺癌患者样本， 进行 NanoSring实验。 具体操作步骤如下： a)利用Qiagen  RNA提取试剂盒提取总RNA， 并利用Nanodrop  2000测定样本浓度和 Agilent 2100生物分析仪测定DV 200； b)样本的总投入量限定在30 ‑150ng， DV200≥30％， 将样本、 探针(捕获探针、 报告探针 和保护探针)、 杂交缓冲液以及 TagSet混匀杂交并将杂交混合物置于67℃的PCR仪器上杂交 16h‑24h； 杂交充分以后， 用RNase ‑free H2O稀释到30～35ul， 将稀释后的杂交物用移液器 转移到Nan oString专用的卡夹中， 按照仪器操作提 示将卡夹 置于nCounter  SPRINT中； c)将样本信息添加至nCounter  SPRINTTM Profiler  Control Center系统， 点击 “Start”即可开始运行； d)系统运行 结束后， 将生成的RC C文件导出； 2)将RCC文件导入nSolver(v4.0)软件中， 首先利用四个管家基因(GAPDH， OAZ1， POLR2A， GUSB)和六个阳性质控品的counts数来判断质控是否合格； 再利用四个管家基因 (GAPDH， OAZ1， POLR2A， GUSB)将counts数进行标准化处理， 将标准化之后的信息导出到 excel表格中； 3)建立阳性阈值计算模型 a)质控标准： 样本中GAP DH基因的原 始数据counts数＞6 00； b)ALK和RET的5 ’和3’端不平衡阳性阈值计算： 利用标准化后的数据先计算每个样本 ALK和RET基因3 ’端的四个探针(3p ‑1、 3p‑2、 3p‑3、 3p‑4)的几何平均数， 定义为E3， 再计算每 个样本5’端的四个探针(5p ‑1、 5p‑2、 5p‑3、 5p‑4)的中位数， 定义为A 5； ALK和RET基因的背景 值定义为B5(具体方法见文献： J  Mol Diagn 2014 Mar； 16(2)： 229 ‑43.A single‑tube  multiplexed  assay for detecting  ALK， ROS1， and  RET fusions in lung cancer)； 取每 个样本中E3/A5(B5)的最小值， 以RNA ‑based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组， 利用ROC 曲线计算阳性阈值； c)ROS1基因5 ’和3’端不平衡计算： 利用标准化后的数据我们先计算每个样本ROS1基因权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114410791 A 23’端的四个探针(3p ‑1、 3p‑2、 3p‑3、 3p‑4)的几何平均数， 定义为E3， 若E3＞700， 可以作为 ROS阳性的初步筛选条件， 若E3＜700， 即可排除阳性结果； 计算E3＞700样本中ROS1基因5 ’ 端的四个探针(5p ‑1、 5p‑2、 5p‑3、 5p‑4)的中位数， 定义为A5； ROS1基因的背景值定义为B5 (具体计算方法见文献： J  Mol Diagn 2014 Mar； 16(2)： 229 ‑43.A single‑tube  multiplexed  assay for detecting  ALK， ROS1， and  RET fusions in lung cancer)； 取每 个样本中E3/A5(B5)的最大值， 以RNA ‑based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组， 利用ROC 曲线计算阳性阈值； d)MET野生型探针的质控： 利用标准化后的数据求得一个批次中阴性质控品counts数 的mean±2SD， 若MET野生型探针(MET ‑MET_E13： E14和MET ‑MET_E14： E15)的counts数大于 mean±2SD， 则认为质控合格， 可以正常判断M ET‑MET_E13： E15； e)融合探针阳性 阈值计算： 将标准化后的counts数除以每批次样本(12个)中各自融合 探针counts数的中位数， 得到的数值用来评估融合探针是否阳性。 求得每个样本中该数值 的最大值作为ROC曲线的值， 以RNA ‑based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组， 并利用ROC 曲线计算阳性阈值； f)阳性结果判定： 若ALK、 RET和ROS1基因检测到5 ’和3’端不平衡， 即可判定为阳性， 其 中若同时检测到ALK、 RET和ROS1的融合探针阳性， 即可判定为某种 融合阳性， 若未检测到 ALK、 RET和ROS1的融合探针阳性， 可判定为某种基因的未知融合类型阳性； 若仅检测到ROS1 融合探针阳性但未检测到ROS1基因的5 ’和3’端不平衡， 亦可判定为ROS1某种融合阳性。 若 ALK和RET基因未检测到5 ’和3’端不平衡， 但检测到ALK和RET的融合探针阳性， 认为可能检 测到的融合为假阳性， 判定为阴性结果。 若MET、 NTRK1/2/3检测到融合探针阳性即可判定为 阳性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114410791 A 3