(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210104809.3 (22)申请日 2022.01.22 (71)申请人 河南省肿瘤医院 地址 450000 河南省郑州市金 水区东明路 127号 (72)发明人 孙瑞　王志中　马杰　郭永军　 王湧森　刘红霞　董兵　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 30/10(2019.01) (54)发明名称 基于NanoString平台检测基因融合用于辅 助诊断软组织肉瘤的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于NanoString平台检 测基因融合用于辅助诊断软 组织肉瘤的方法。 该 方法包括： 1、 基因融合信息收集和管家基因确 定； 2、 探针设计； 3、 建立阳性阈值计算模型和阳 性结果判定； 它收集了目前软 组织肉瘤用于辅助 诊断的大部分融合类型， 包括高频融合和低频融 合， 并确定了每个基因融合断点处的上下游序 列。 可以满足一次性平行检测多个融合类型的需 求； 基于element方法设计探针； 以FISH作为金标 准对照， 以FISH作为金标准对照， 并以自建的算 法确定阳性融合判定阈值， 减少主观判断带来的 误差。 权利要求书1页 说明书19页 CN 114369665 A 2022.04.19 CN 114369665 A 1.基于NanoString平台检测基因融合用于辅助诊断软组织肉瘤的方法， 所述方法的具 体步骤如下： (1)基因融合信息收集和管家基因确定 以NCCN软组织肉瘤诊疗指南(2020.v2)推荐的用于辅助诊断的融合为基本指导， 收集 融合的5’基因和3’基因； 在COSMIC数据库中通过检索融合， 再收集融合的5 ’基因和3’基因 的具体断点信息， 最后根据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序列； 在 PubMed数据库中检索软组织肉瘤相关的融合报道， 确定融合基因信息和断点信息， 最后根 据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序列； 选择在软组织肉瘤中具有不 同表达量的四个管家基因GAP DH， OAZ1， POLR2 A， GUSB用作质控和标准 化； (2)探针设计 依据每个融合亚型断点处的上下游序列分别设计探针A、 探针B和保护探针， 在管家基 因的保守区设计探针， 包括探针A和探针B； (3)建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定， 收集经过EWSR1、 FUS和SS18基因的FISH探 针检测为阳性和阴性的软组织肉瘤样本， 进行Nan oSring实验； 具体操作步骤如下： a)利用Qiagen  RNA提取试剂盒提取总RNA， 并利用Nanodrop  2000测定样本浓度和 Agilent 2100生物分析仪测定DV 200； b)样本的总投入量限定在30 ‑150ng， DV200≥30％， 将样本、 探针(捕获探针、 报告探针 和保护探针)、 杂交缓冲液以及 TagSet混匀杂交并将杂交混合物置于67℃的PCR仪器上杂交 16h‑24h； 杂交充分以后， 用RNase ‑free H2O稀释到30～35ul， 将稀释后的杂交物用移液器 转移到Nan oString专用的卡夹中， 按照仪器操作提 示将卡夹 置于nCounter  SPRINT中； c)将样本信息添加至nCounter  SPRINTTM Profiler  Control Center系统， 点击 “Start”即可开始运行； d)系统运行 结束后， 将生成的RC C文件导出； e)将RCC文件导入nSolver(v4.0)软件中， 首先利用四个管家基因(GAPDH， OAZ1， POLR2A， GUSB)和六个阳性质控品的counts数来判断QC是否合格； 再利用四个管家基因 (GAPDH， OAZ1， POLR2A， GUSB)将counts数进行标准化处理， 将标准化之后的信息导出到 excel表格中， 用作计算每 个样本中各个融合探针的counts数； f)质控标准： 样本中GAP DH基因的原 始数据counts数＞6 00。 g)融合探针阳性阈值计算： 以FISH结果为标准分为阳性组和阴性组。 将标准化后的 counts数除以每批次样 本(12个)中各自融合探针counts数的中位数， 得到的数值用来评估 融合探针是否阳性。 求得每个样本中该数值的最大值作为ROC曲线的值， 并利用ROC曲线计 算阳性阈值。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369665 A 2基于NanoString平台检测基因融合用于辅助诊断软组织肉瘤 的方法 技术领域 [0001]本发明涉及软组织肉瘤领域， 尤其是涉及一种基于NanoString平台检测基因融合 用于辅助诊断软组织肉瘤的方法。 背景技术 [0002]软组织肉瘤因在病理学中亚型最多， 也最为复杂， 因此一直是诊断中的难题。 除部 分可根据临床特点和细胞形态直接做出诊断外， 大多 数需通过其他分子病理学检测来辅助 诊断。 一半以上的软组织肉瘤具有特定遗传改变， 目前在约1/3的软组织肉瘤中检出融合， 所以应考虑使用辅助分子检查。 [0003]目前多种分子检测技术通过检测基因融合应用在软组织肉瘤的辅助诊断中， 检测 方法主要有荧光原位杂交技术(FISH)、 聚合 酶链反应(PCR)、 一代测序(Sanger测序)和二代 测序(NGS)。 但是由于融合基因断点不集中， 伴侣基因繁多， 有些融合出现频次少， 非常罕 见。 目前的检测方法仍有很多局限性： [0004]1、 FISH方法常用的断裂探针只能检测某种基因是否有易位或重排但不能判定其 伴侣基因。 融合探针可以帮助确定具体的基因融合类型， 但检测则成本高， 并不适合临床常 规开展。 该方法也不满足同时检测多个基因融合的需求。 人工判断的主观性较大， 且经常出 现不典型信号不易判断。 2、 PCR检测的融合类型受引物的限制， 种类较少， 尤其是对罕见融 合的检测 有局限性。 此外， PCR容易因PCR 的交叉污染而出现假阳性。 3、 Sanger测序与PCR类 似， 通常检测类型较少以及容易交叉污染， 且检测 灵敏度较低。 4、 NGS一般对样本质量要求 较高， 且检测周期长， 判读结果复杂。 发明内容 [0005]本发明的目的是针对上述现有技术的不足， 而提供一种基于NanoString平台检测 基因融合用于辅助诊断软组织 肉瘤的方法。 为了解决上述技术问题， 本发明所采取 的技术 方案是： 一种基于NanoString平台检测基因融合用于辅助诊断软组织肉瘤的方法， 所述方 法的具体步骤如下： [0006]1、 基因融合信息收集和管家基因确定 [0007]以NCCN软组织肉瘤诊疗指南(2020.v2)推荐的用于辅助诊断的融合为基本指导， 收集融合的5 ’基因和3’基因； 在COSMIC数据库中通过检索融合， 再收集融合的5 ’基因和3’ 基因的具体断点信息， 最后根据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序 列； 在PubMed数据库中检索软 组织肉瘤相关的融合报道， 确定融合基因信息和断点信息， 最 后根据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序列； 选择在软组织肉瘤中具 有不同表达量的四个管家基因GAP DH， OAZ1， POLR2 A， GUSB用作质控和标准 化； [0008]2、 探针设计 [0009]依据每个融合亚型断点处的上下游序列分别设计探针A、 探针B和保护探针， 在管说　明　书 1/19 页 3 CN 114369665 A 3