(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210075296.8 (22)申请日 2022.01.22 (71)申请人 北京新基永康生物科技有限公司 地址 102600 北京市大兴区北京经济技 术 开发区科创十四街99号2幢201室、 402 室 (72)发明人 任鹏飞　韩敏　韩晶　王俊峰　 王玉朗　 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于实时荧光定量PCR方法检测幽门螺 杆菌的引物和探 针组合物及其应用、 试剂盒 (57)摘要 本申请涉及生物检测技术领域， 具体公开了 一种基于实时荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌 的引物和探针组合物及其应用、 试剂盒。 所述引 物和探针组合物包括用于检测幽门螺杆菌的 UreA靶标基因的引物和探针、 人源RNP内参基因 引物和探针。 所述引物和探针组合物在制备用于 检测幽门螺杆菌的试剂或试剂盒的应用。 所述试 剂盒包括主要由上述引物和探针组合物、 dNTPs 和缓冲液组成的反应液A， 主要由DNA聚合酶组成 的反应液B， 阳性对照， 临界阳性对照和阴性对 照。 本申请将UreA 基因作为幽门螺 杆菌的靶标检 测基因， 更有利于检出幽门螺杆菌且 具有较高的 特异性。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114574602 A 2022.06.03 CN 114574602 A 1.一种基于实时荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌的引物和探针组合物， 其特征在于， 包括用于检测幽门螺杆菌的UreA靶标基因的引物和探针、 人源RNP内参基因引物和探针； 所述UreA靶标基因的引物及探针的核苷酸序列为： SEQ ID NO.1： 5'‑TGGAAGAAGCGAGAGCTG GTAA‑3' SEQ ID NO.2： 5'‑ATGGATCATGCT TGCCACAC‑3' SEQ ID NO.3： 5'‑GCTGAATTGATGCAAGAAGGGCGC‑3' 所述SEQ ID NO.3的5'端标记荧 光报告基团、 3'端标记荧 光淬灭基团； 所述人源RNP内参基因的引物及探针的核苷酸序列为： SEQ ID NO.4： 5'‑TTTGCAGATTTGGACCTGC‑3' SEQ ID NO.5： 5'‑GGTGAGCGGCTGTCTC CACA‑3' SEQ ID NO.6： 5'‑GGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG ‑3' 所述SEQ ID NO.6的5'端标记荧 光报告基团、 3'端标记荧 光淬灭基团； 所述SEQ ID NO.3的荧 光报告基团和所述SEQ  ID NO.6的荧 光报告基团不同。 2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物， 其特征在于， 所述SEQ  ID NO.3的荧光报 告基团为FAM、 荧 光淬灭基团为BHQ1。 3.根据权利要求1所述的引物和探针组合物， 其特征在于， 所述SEQ  ID NO.6的荧光报 告基团Hex、 荧 光淬灭基团为BHQ1。 4.如权利要求1至3中任意一项所述的引物和探针组合物在制备用于检测幽门螺杆菌 的试剂或试剂盒的应用。 5.一种基于实时荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒 包括主要由如权利要求1至3中任意一项所述的引物和探针组合物、 dNTPs和缓冲液组成的 反应液A， 主 要由DNA聚合酶组成的反应液B， 阳性对照， 临界阳性对照和阴性对照。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照主要由包含UreA靶标基因 的pUC57载体质粒和包含 人源RNP内参基因pUC57载体质粒 组成； 所述阳性对照中， 所述包含 UreA靶标基因的pUC57载体质粒的浓度为1 ×103copies/μL， 所述包含人源RNP内参基因 pUC57载体质粒的浓度为1 ×103copies/ μL。 7.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述临界阳性对照主要由包含UreA靶标 基因的pUC57载体质粒和包含 人源RNP内参基因p UC57载体质粒 组成； 所述临界阳性对照中， 所述包含UreA靶标基因的pUC57载体质粒的的浓度为50copies/ μL， 所述包含人源RNP内参 基因pUC57载体质粒的浓度为5 0copies/ μL。 8.根据权利要求5所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述阴性对照主要由不包含任何基因的 pUC57空载体质粒组成； 所述阴性对照中， 所述不包含任何基因的pUC57空载体质粒的浓度 为1×103copies/ μL。 9.根据权利要求5至8中任意一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的使用方法 包括如下步骤： (1)提取待测样本DNA； (2)单管多重荧 光定量PCR反应： 使用试剂盒进行单管多重荧光定量PCR反应， 分别得到待测 样本的实时荧光定量PCR扩 增曲线、 阳性对照的实时荧光定量PCR扩增曲线、 临界阳性对照的实时荧光定量PCR扩增曲权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114574602 A 2线、 阴性对照的实时荧 光定量PCR扩增曲线； (3)结合待测样本、 阳性对照、 临界阳性对照、 阴性对照的实时荧光定量PCR扩增曲线判 断幽门螺杆菌的感染情况； 优选的， 所述实时荧光定量PCR反应 的扩增程序为： 94℃预变性3min， 进行1个循环； 94 ℃变性15s， 58℃退火与延伸40s， 进行40个 循环。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述幽门螺杆菌的感染情况的判断标 准如下： ①阳性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应有明显扩增， 有典型S型 曲线， 且Ct值应在18.0 0～24.00之间； ②临界阳性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应有明显扩增， 有典型 S型曲线， 且Ct值小于 35.00； ③阴性对照在靶标基因荧 光通道及内参基因荧 光通道上均应无明显扩增； ④待测样本的内参基因荧光通道上均应有明显扩增， 且Ct值≤35.00， 否则该待测 样本 的检测结果 不成立； ⑤在满足①～④的前提下， 若待测 样本的靶标基因荧光通道上的Ct值≤35.00， 则为阳 性； 若待测样本的靶标基因荧 光通道上的Ct值＞3 5或无扩增信号， 则为阴性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114574602 A 3