(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210076532.8 (22)申请日 2022.01.24 (71)申请人 华智生物技 术有限公司 地址 410125 湖南省长 沙市芙蓉区合平路 618号 (72)发明人 曹桂元　唐顺学　田冰川　易丽媛　 许美娟　 (74)专利代理 机构 长沙智路知识产权代理事务 所(普通合伙) 4324 4 代理人 陈建国 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种高通量、 低成本检测三嗪类除草剂耐受 型油菜的鉴别方法 (57)摘要 本发明提出了一种高通量、 低成本检测三嗪 类除草剂耐受型油菜的鉴别方法， 属于农业技术 领域。 包括： S1.从油菜种子或者叶片中提取基因 组DNA； S2.基于现有油菜品种基因的DNA序列， 共 获得若干SNP位点， 开发出KASP引 物； S3.将提取 的DNA配制PCR反应体系进行PCR扩增反应， 反应 结束后， 根据检测的荧光信号来判断样本分型情 况， 根据不同的荧光信号获得不同的基因型， 包 括TT型油 菜、 TS型油 菜和TS/TT的杂合型； S4.TT 型油菜和TS/TT的杂合型判断为耐受型油菜。 可 用于种子和叶片材料的检测， 利用自动化仪器检 测通量高， 一天内可完成上万份材料的检测， 成 本低于现有的分子 检测方法。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图1页 CN 114107553 A 2022.03.01 CN 114107553 A 1.一种高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： S1.DNA提取： 从油菜种子或者叶片中提取基因 组DNA； S2.KASP引物合成： 基于现有油 菜品种基因的DNA序列， 共获得SNP位点， 开发出KASP引 物； 所述SNP位 点是psbA基因第790位； S3.KASP反应： 将提取的DNA配制PCR反应体系进行PCR扩增反应， 反应结束后， 根据检测 的荧光信号来判断样本 分型情况， 根据不同的荧光信号 获得不同的基因型， 包括TT 型油菜、 TS型油菜和TS/T T的杂合型； S4.耐受型油菜的鉴别： 其中T T型油菜和TS/T T的杂合型判断为耐受型油菜。 2.根据权利要求1所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 其特 征在于， 步骤S2中所述KASP引物包括BN ‑TT.1和BN ‑TT.2； 所述BN ‑TT.1和BN ‑TT.2均包括两 条特异性引物和一条通用引物。 3.根据权利要求2所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 所述 BN‑TT.1的Pri mer_Allele  X特异性引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示； 所述BN ‑TT.1的 Primer_Allele  Y特异性引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所述BN ‑TT.1的通用引物 Primer_C的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示。 4.根据权利要求2所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 所述 BN‑TT.2的Pri mer_Allele  X特异性引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示； 所述BN ‑TT.2的 Primer_Allele  Y特异性引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示； 所述BN ‑TT.2的通用引物 Primer_C的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 6所示。 5.根据权利要求1所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 步骤 S3中所述PCR反应 体系如下： 100 μM Primer_Al lele X： 0.003 μl； 100 μM Primer_Al lele Y： 0.0013 μl； 100 μM Primer_C： 0.0 013 μl； 2x KASP Master Mix： 0.3945 μl； 超纯水： 补足至 0.8 μl。 6.根据权利要求1所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 步骤 S3中所述PCR扩增条件如下： 94℃15min； 94℃  20s， 65℃‑57℃退火60s， 10个循环， 每个循环 退火温度降低0.8℃； 94℃20s， 57℃6 0s， 30个循环。 7.根据权利要求1所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 步骤 S3中所述不同的荧光信号检测中， 如果样品PCR产物只检测到引物Primer_Allele  X对应荧 光信号， 则检测位点为碱基A， 判定待测材料为纯合不 耐受型油菜； 若只检测到引物Primer_ Allele Y对应荧光信号， 则检测位点为碱基G， 判定待测材料为TT型油菜； 若同时检测到两 种荧光信号， 则检测位 点为A： G， 判断待测材 料为TS/T T的杂合型油菜。 8.根据权利要求7所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂 耐受型油菜的鉴别方法， 步骤 S3中所述不同的荧光信号检测结果中， 位于右下角的为TT型油菜， 位于左 上角的为TS型油 菜， 位于中间的为TS/T T的杂合型油菜。 9.根据权利要求1所述高通量、 低成本检测三嗪类除草剂耐受型油菜的鉴别方法， KASP权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114107553 A 2反应和验证用Array  Tape系统进行， 包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、 PCR扩增反应的 SOELLEX、 荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的I NTELLICS。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114107553 A 3