(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210077428.0 (22)申请日 2022.01.24 (71)申请人 浙江农林大 学暨阳学院 地址 312000 浙江省绍兴 市诸暨市暨阳街 道浦阳路77号 (72)发明人 金松恒　申建双　胡玥　 (74)专利代理 机构 绍兴市寅越专利代理事务所 (普通合伙) 33285 专利代理师 潘敏 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力 的检测分析方法 (57)摘要 本发明属于植物基因工程技术领域， 具体涉 及一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的 检测分析方法。 本发明分别在RpHsfC1和 RpHsfC1‑like基因的全长序列中选取一个目标 片段， 扩增目标基因片段与病毒载体重组， 构建 VIGS载体， 将VIGS载体转化至杜鹃， 通过荧光定 量表达分析， 结果发现经过VIGS沉默的目的基因 的表达量受到抑制， 说明成功沉默了目的基因， 获得转基因植株。 通过对沉默后植株进行光合荧 光特征的分析， 发现经过VIGS沉默掉目的基因 RpHsfC‑1 like和RpHsfC ‑1都对杜鹃耐热能力产 生了影响。 本发明通过初步鉴定基因的调控耐热 能力， 为杜鹃耐热性品种的培育提供了基因来 源。 权利要求书2页 说明书10页 序列表3页 附图10页 CN 114703219 A 2022.07.05 CN 114703219 A 1.一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 构建含有 用于沉默耐热基因特异性片段的重组病毒载体， 转化到农杆菌感受态细胞制备侵染菌液， 将所述侵染菌液侵染的杜鹃， 对所述耐热基因的功 能进行鉴定分析， 所述用于沉默耐热基 因特异性片段为用于沉默RpHsfC ‑1like基因特异性片段或用于沉默RpHsfC ‑1基因特异性 片段， 所述用于沉默RpHsfC ‑1like基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述 用于沉默RpHsfC ‑1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.根据权利要求1所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 包括如下步骤； S1， 提取杜鹃叶片RNA， 反转录获得 杜鹃cDNA； S2， 利用引物1和引物2对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增， 纯化获得用于沉默RpHs fC‑1like 基因特异性片段， 利用引物3和引物4对进行杜鹃cDNA片段PCR扩增， 纯化获得用于沉默 RpHsfC‑1基因特异性片段； S3， 将步骤S2中的用于沉默RpHsfC ‑1like基因特异性片段、 用于沉默RpHsfC ‑1基因特 异性片段分别与烟草脆裂病毒pTRV2进行重组连接， 获得重组载体pTRV2 ‑HsfC‑1like、 pTRV2‑HsfC‑1； S4， 将步骤S3中重组载体pTRV2 ‑HsfC‑1like、 pTRV2 ‑HsfC‑1以及pTRV1分别转化到农杆 菌GV3101感受态细胞， PCR鉴定阳性， 分别获得含重组载体pTRV2 ‑HsfC‑1like的菌液、 含重 组载体pTRV 2‑HsfC‑1的菌液以及含pTRV1的菌液； S5， 将步骤S4的含重组载体pTRV2 ‑HsfC‑1like的菌液、 含重组载体pTRV2 ‑HsfC‑1的菌 液分别与含pTRV1的菌液以体积比1： 1混匀， 即为侵染 夜， 将所述侵染液侵染杜鹃叶片； S6， 将侵染成功的杜鹃进行正常培养7天， 后模拟自然高温条件进行高温胁迫处理， 检 测HsfC‑1like、 HsfC ‑1对在杜鹃的耐性响应中的功能， 以及在杜鹃叶片光系统、 光保护机 制、 电子传递对高温胁迫响应的作用。 3.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 在步骤S2中， 所述引物1的核苷酸序列为SEQ  ID NO.3所示， 所述引物2的核苷 酸序列为SEQ  ID NO.4所示。 4.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 在步骤S2中， 所述引物3的核苷酸序列为SEQ  ID NO.5所示， 所述引物4的核苷 酸序列为SEQ  ID NO.6所示。 5.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 在步骤S4中， 浸染方式如下： 用无菌注 射器在杜鹃叶片背部 分别进行注射接种 含重组载体pTRV 2‑HsfC‑1like和pTRV1的菌液、 含重组载体pTRV 2‑HsfC‑1和pTRV1的菌液。 6.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 在步骤S5中， 所述高温胁迫处 理的温度为 40℃/32℃(昼12h /夜12h)。 7.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 在步骤S5中， 高温胁迫处理胁迫第5 d后选取杜鹃新梢顶叶下的第3 ‑4层叶片， 进行功能验证。 8.根据权利要求2所述的一种杜鹃热激转录因子Hsfs调控耐热能力的检测分析方法， 其特征在于， 在步骤S 5中， 所述耐性响应中的功能分析包括叶绿素荧光参数、 叶绿素荧光诱权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114703219 A 2导曲线， 所述杜鹃叶片光系统、 光保护机制、 电子传递对高温胁迫响应的作用包括JIP ‑ test、 延迟荧 光DF、 820nm反射 光谱测定 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114703219 A 3