(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210077014.8 (22)申请日 2022.01.24 (71)申请人 山东省海洋资源与环境研究院 （山 东省海洋环境监测中心、 山 东省水 产品质量检验中心） 地址 265503 山东省烟台市经济开发区长 江路216号 申请人 中国石油大 学 （华东） (72)发明人 李凡　陈翠霞　李慧　马元庆　 苏海霞　杨艳艳　张孝民　周兴　 (74)专利代理 机构 山东三邦知识产权代理事务 所(普通合伙) 37308 代理人 高洋　肖太升 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种快速检测三疣梭子蟹资 源量动态变化的方法， 属于三疣梭子蟹资源量分 析技术领域。 本发明的方法是采用被检测海域的 柱状沉积物样品， 提取柱状沉积物样品中的DNA， 并以不同深度柱状沉积物样品的DNA为模板， 采 用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引物对， 进行 荧光定量PCR扩增； 根据扩增曲线获得不同样品 DNA扩增后的Ct值； 然后对照三疣梭子蟹COI基因 拷贝数与Ct值的标准曲线， 获得不同深度柱状沉 积物样品DNA中COI基因的拷贝数； 最后根据测得 的不同深度柱状沉积物样品的同位素年代， 获得 疣梭子蟹资源量动态变化结果。 该方法真实可 信， 具有较高的检出率， 为分析影响三疣梭子蟹 资源量动态变化的因素奠定 基础。 权利要求书2页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 114350823 A 2022.04.15 CN 114350823 A 1.一种快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特 征在于， 步骤如下： (1)采集被检测海域的柱状沉积物样品， 柱状沉积物采集时， 以1 ‑2cm为一个采集深度， 采集若干个不同深度的柱状沉积物， 记为A1、 A 2、 A3、 A4…An； 样品采集后低温保存； (2)提取采集的不同深度柱状沉积物样品中的DNA； (3)以不同深度柱状沉积物样品的DNA为模板， 采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量引 物对， 进行荧 光定量PCR扩增； 根据扩增曲线获得不同样品DNA扩增后的Ct值； (4)将获得的不同样品DNA扩增后的Ct值对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准 曲线， 获得不同深度柱状沉积物样品DNA中COI基因的拷贝数； (5)测定柱状沉积物A1、 A2、 A3、 A4 …An的同位素年代， 并根据 年代绘制不同深度柱状沉 积物样品DNA中COI基因的拷贝数与年代的关系图， 即得三疣梭子蟹资源量动态变化结果。 2.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 所述 步骤(4)中三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线由以下 方法获得： 提取三疣梭子蟹基因组DNA作为模板， 利用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增， 检 测扩增产物中COI基因的浓度并计算COI基因的拷贝数； 根据扩增产物 中COI基因的拷贝数 将扩增产物稀释成不同拷贝数梯度的溶液作为模板， 采用三疣梭子蟹COI基因的荧光定量 引物对， 进行荧光定量PCR扩增； 根据扩增曲线获得不同拷贝数梯度的溶液扩增后的Ct值， 以Ct值为横坐标， 用已知起始拷贝数的对数为纵坐标， 绘制三疣梭子蟹COI基因的标准曲 线。 3.根据权利要求2所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 所述 三疣梭子蟹COI基因的引物对如下： 正向序列COI  for为： 5’ ‑TCGTGCTGA ATTAGGACAACC‑3’； 反向序列COI  rev为： 5’ ‑AAGGAGAGAATATAACAGGCCGAC‑3’。 4.根据权利要求3所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 以三 疣梭子蟹基因组DNA为模板， 采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR扩增程序 为： 95℃预变性5min； 95℃变性50s， 52℃退火45s， 72℃延伸1min， 35个循环； 72℃复延伸 10min； 4℃保存并结束程序。 5.根据权利要求3所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 以三 疣梭子蟹基因组DNA为模板， 采用三疣梭子蟹COI基因的引物对进行扩增时的PCR反应体系 为25μL反应体系， 具体包括： 2 ×GC buffer I 12.5μL， 2.5mM  dNTP Mixture 4μL， 5U/μL   TaKaRa LA Taq 0.25 μL， 模板DNA  1 μL， 10mM上、 下游引物各1 μL， 无菌去离 子水5.25 μL。 6.根据权利要求1 ‑5任一项所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征 在于， 所述 三疣梭子蟹COI基因的荧 光定量引物对如下： 正向序列COI ‑qRTPCR for为： 5’ ‑GGGAGCAGTCT TTGGCATCT‑3’； 反向序列COI ‑qRTPCR rev为： 5’ ‑GCCTCAGGTAGTATA AGCGTCT‑3’。 7.根据权利要求6所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 所述 三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR扩增程序为： 95℃预变性30s； 95℃变性5s， 57℃退火 30s， 72℃延伸32s， 40个 循环。 8.根据权利要求6所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 所述 三疣梭子蟹COI基因的荧光定量PCR反应体系为20μL反应体系， 其中包括 Premix 权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114350823 A 2ExTaqTM 10 μL， 10 μM上、 下游引物各0.4 μL， 模板2 μL， ROXI I 0.4 μL， 水6.8 μL。 9.根据权利要求1所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 所述 步骤(2)在提取采集的不同深度 柱状沉积物样品中的DNA前， 将采集的每个柱状沉积物分为 相等的两份， 每份 设置9个均布的采样点， 在9个采样点分别取1 g样品， 之后将9个样品混匀， 再将混匀后的样品分成3份， 分别进行沉积物样品DNA提取。 10.根据权利要求9所述快速检测三疣梭子蟹资源量动态变化的方法， 其特征在于， 所 述步骤(3)以提取的不同深度沉积物样品中的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增时； 根据DNA 扩增曲线， 获得的同一个深度沉积物样品的不同DNA模板扩增 后的Ct值取平均值， 采用得到 的Ct平均对照三疣梭子蟹COI基因拷贝数与Ct值的标准曲线， 获得不同深度柱状沉积物样 品 DNA中COI基因的拷贝数。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114350823 A 3