(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210079030.0 (22)申请日 2022.01.24 (71)申请人 广东省林业科 学研究院 地址 510520 广东省广州市天河区广汕一 路233号 (72)发明人 白青松　何波祥　汪迎利　连辉明　 陈杰连　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 代理人 刘瑜 (51)Int.Cl. G16B 20/20(2019.01) G16B 20/30(2019.01) G16B 30/10(2019.01) C12Q 1/6895(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种马尾松高产脂功能SNP标记的筛选方法 及其应用 (57)摘要 本发明中公开了一种 马尾松高产脂功能SNP 标记的筛选方法及其应用。 该方法包括如下步 骤： 采集无性系马尾松的松 脂并分别测定其产脂 力大小， 再从产脂力高、 中、 低的无性系马尾松样 本中收集组织材料， 提取RNA后进行PacBio全长 转录组测序， 同时开展二代转录组、 代谢组、 蛋白 组测序并进行差异表达分析筛选候选基因， 以此 开发SNP功能标记。 本发明方法只需针对少数样 品进行转录组等多组学测序， 具有较高的SNP位 点开发效率， 开发成本较低， 研发的SNP标记有助 于实现马尾松产脂力性状早期选择， 可用在分子 辅助选择育种领域。 权利要求书3页 说明书13页 序列表12页 附图4页 CN 114255822 A 2022.03.29 CN 114255822 A 1.一种马尾松高产脂功能SNP标记的筛 选方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)依据表型选择 材料 采集m个无性系马尾松 的松脂， 每个无性系马尾松选择n个植株， 然后根据产脂力计算 公式分别计算其产脂力， 并计算每个植株产脂力的平均值； 接着分别以每个无性系马尾松 的产脂力最大 的植株作为高产脂力植株， 以产脂力最小的植株作为低产脂力植株， 以产脂 力等于或接近产脂力平均值的植株作为中产脂力植株； 再分别采集每个无性系马尾松的 高、 中、 低产脂力植株的次生木质部组织材料； 其中， m≥3， n≥3； 产脂力RYC的计算公式如 下： 式中： Wt表示松脂总重量； D表示每棵树切割树脂的次数； Wd表示割面宽度； C表示树皮 被切割处的树干周长； (2)基于多组学 数据联合分析筛 选候选基因 对步骤(1)中采集的每个无性系马尾松的高、 中、 低产脂力植株的组织材料分别进行转 录组和代谢组测序， 同时将所有组织材料混合后进行PacBio全长转录组测序； 然后利用多 组学数据进行差异 表达分析， 并根据转录组与代谢组联合分析初步筛 选得到候选基因； (3)qRT‑PCR验证基因表达量 分别提取每个无性系马尾松的高、 中、 低产脂力植株的组织材料的RNA， 并将其反转录 为cDNA， 然后采用qRT ‑PCR方法验证步骤(2)中筛选得到的候选基因的表达量， 选择差异表 达的基因用于SNP位 点开发； (4)开发SNP位 点 分别提取每个无性系马尾松的高、 中、 低产脂力植株的组织材料的DNA， 然后进行PCR全 长扩增， 再直接进行高、 中、 低产脂力植株的序列相互比较开发SNP分子标记， 筛选得到SNP 位点； (5)开发产脂力性状功能SNP位 点 根据步骤(4)中筛选得到的SNP位点， 对每个无性系马尾松的高、 中、 低产脂力植株的基 因型进行关联分析， 得到与产脂力性状显著相关的SNP标记， 进而筛选得到马尾松高产脂功 能SNP标记。 2.根据权利要求1所述的马尾松高产脂功能SNP标记的筛 选方法， 其特 征在于： 步骤(1)中所述的m的取值范围为： m≥20； 步骤(1)中所述的n的取值范围为： n≥5； 步骤(2)中所述的候选基因为选择3个以上的候选基因。 3.根据权利要求2所述的马尾松高产脂功能SNP标记的筛 选方法， 其特 征在于： 步骤(1)中所述的m的取值范围为： m≥5 0； 步骤(1)中所述的n的取值范围为： 5 ≤n≤20； 步骤(2)中所述的候选基因为选择5个以上的候选基因。 4.根据权利要求3所述的马尾松高产脂功能SNP标记的筛 选方法， 其特 征在于： 步骤(2)中所述的候选基因为MG7、 MG25、 MG26、 MG27、 MG36基因， 其核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1～5所示。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114255822 A 25.根据权利要求1所述的马尾松高产脂功能SNP标记的筛 选方法， 其特 征在于： 步骤(1)中所述的松脂的采集时间为每年的7～ 9月； 步骤(1)中所述的组织材料的采集部位 高度与割脂部位相同， 采集时间以中午12点～1 点晴朗天气； 步骤(1)中所述的中产脂力植株选择产脂力为中位数对应的植株作为中产脂力植株； 步骤(1)中所述的无性系马尾松的树龄10年生以上或胸径达到16cm以上的无性系马尾 松； 步骤(1)中所述的组织材 料包括次生木质部、 成熟针叶、 成熟枝条或未成熟枝条。 6.根据权利要求1所述的马尾松高产脂功能SNP标记的筛 选方法， 其特 征在于： 步骤(3)中所述的qRT ‑PCR方法中所用的引物序列如SEQ  ID NO.19～28所示； 步骤(3)中所述的qRT ‑PCR方法中的扩增反应程序为： 变性温度95℃持续10秒， 退火温 度57℃～62℃持续3 0秒， 延伸温度72℃持续20秒； 步骤(4)中所述的PCR全长扩增所用的引物序列如SEQ  ID NO.29～38所示； 步骤(4)中所述的PCR全长扩增的反应程序 为： 预变性温度94℃持续5分钟， 变性温度94 ℃持续1分钟， 退火温度5 5℃～63℃持续3 0秒， 延伸温度72℃持续时间1～3分钟。 7.根据权利要求1所述的马尾松高产脂功能SNP标记 的筛选方法， 其特征在于， 在步骤 (2)之后、 步骤(3)之前还 包括如下至少一个步骤： a、 利用GO、 KEGG数据库对差异基因进行功能和代谢通路注释， 并选择功能基因并使用 候选基因FPKM值进行表达分析； b、 采集的每个无性系马尾松的高、 中、 低产脂力植株的其他组织材料， 分析候选基因 的 表达量， 即对候选基因进行表达验证； c、 根据PacBio全长转录组测序数据库获得候选基因的全长序列， 利用NCBI保守结构域 搜索软件和Pfam保守结构域数据库分析确定 差异基因的所属基因家族。 8.根据权利要求1所述的马尾松高产脂功能SNP标记 的筛选方法， 其特征在于： 在步骤 (4)之后、 步骤(5)之前还 包括SNP位 点在群体的多态性验证的步骤， 具体如下： 在SNP标记所在位点的两端序列设计引物， 然后提取马尾松种质资源的基因组DNA， 进 行PCR扩增与序列比对， 验证SNP标记与产脂力性状的相关性。 9.权利要求1～8任一项所述的马尾松高产脂功能SNP标记的筛选方法在筛选马尾松高 产脂功能SNP标记或马尾松育种方面的应用。 10.一种马尾松高产脂功能SNP标记， 其特 征在于： 所述的SNP标记为如下任一种： (1)位于SEQ  ID NO.6所示的核苷酸序列， 其中自5 ’端起第76位碱基中的等位基因为T/ C； (2)位于SEQ  ID NO.7所示的核苷酸序列， 其中自5 ’端起第78位碱基和第1073位碱基中 的等位基因均为T/ C； (3)位于SEQ  ID NO.8所示的核苷酸序列， 其中自5 ’端起第169位碱基中的等位基因为 C/T； (4)位于SEQ  ID NO.9所示的核苷酸序列， 其中自5 ’端起第128位碱基中的等位基因为 T/G； (5)位于SEQ  ID NO.10所示的核苷酸序列， 其中自5 ’端起第103位碱基中的等位基因为权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114255822 A 3