(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210076598.7 (22)申请日 2022.01.24 (71)申请人 广州迪澳医疗科技有限公司 地址 510000 广东省广州市黄埔区科丰路 31号G11栋602房 (72)发明人 陈皇佑　何潘敏　 (74)专利代理 机构 广州博联知识产权代理有限 公司 44663 专利代理师 宋佳 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 恒温条件检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性 的方法与试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物检测技术领域， 具体涉及一 种于恒温条件下检测结核分枝杆菌异烟肼耐药 性的方法与试剂盒。 本发明提供一种引物组合， 其包括用于特异性扩增KatG基因和InhA基因的 内引物、 外引物和环引物， 以及分子信标探针。 本 发明还提供了相应的试剂盒和检测方法。 本发明 提供的检测方法可以在恒温条件下对待测样本 进行结核分枝杆菌异烟肼 耐药性的检测， 具有检 测速度快、 灵敏度高、 特异性强的优点。 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 114480683 A 2022.05.13 CN 114480683 A 1.一种用于检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的引物组合， 其特征在于， 所述引物组合 包括引物组I和引物组I I； 所述引物组I包括外引物K atG‑F3、 外引物K atG‑B3、 内引物K atG‑FIP、 内引物K atG‑BIP、 环引物KatG ‑LB； 所述外引物KatG ‑F3的核苷酸序列为ACGACGTCGA AACAGCGG(SEQ ID NO： 1)， 所述外引物KatG ‑B3的核苷酸序列为C CCACTCGTAGC CGTACAGG(SEQ ID NO： 2)， 所述内引物KatG ‑FIP的核苷酸序列为AGCGGAGCAGCCTCGGGTTCGCACACTTTCGGTAAGACCCA (SEQ ID NO： 3)， 所述内引物KatG ‑BIP的核苷酸序列为GCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGCTGTTGTCCCATTTCG TCG(SEQ ID NO： 4)， 所述环引物KatG ‑LB的核苷酸序列为ATCAC CAGCGGCATCGAG GTCG(SEQ  ID NO： 5)； 所述引物组II包括外引物InhA ‑F3、 外引物InhA ‑B3、 内引物InhA ‑FIP、 内引物InhA ‑ BIP、 环引物I nhA‑LB； 所述外引物I nhA‑F3的核苷酸序列为TCGTAG GGCGTCAATACACC(SEQ ID NO： 6)， 所述外引物I nhA‑B3的核苷酸序列为CTC CGGTAACCAGGACTGAA(SEQ ID NO： 7)， 所述内引物InhA ‑FIP的核苷酸序列为CTGGGGTTACGCTCGTGACGCCAGAAAGGGATCCGTCA (SEQ ID NO： 8)， 所述内引物InhA ‑BIP的核苷酸序列为ACTGAAGGGGCCAAACCCGGGTTTGGCCCCTTCAGT(SEQ   ID NO： 9)， 所述环引物I nhA‑LB的核苷酸序列为GAGACGATAG GTTGTCGGGGTGACT(SEQ  ID NO： 10)。 2.如权利 要求1所述的引物组合， 其特征在于， 还包括分子信标探针katG ‑M和分子信标 探针inhA‑M； 所述分子信标探针katG ‑M的核苷酸序列为CGAGCCGACCTGGATGCCGCTGATGGCTCG(SEQ  ID  NO： 11)， 所述分子信标探针inhA ‑M的核苷酸序列为CAGCCAGTCACCGCCACAACCTATCGTCTCGCCGGC TG(SEQ ID NO： 12)。 3.如权利 要求2所述的引物组合， 其特征在于， 所述分子信标探针katG ‑M和所述分子信 标探针inhA‑M各自独立 地含有选自下组的修饰： 所述分子信标探针的5 ’端修饰有荧光基团， 选自FAM、 HEX、 ROX、 TAMRA、 Texas  RED、 CY5、 Cy3、 TET、 JOE、 VIC中的一种或多种； 所述分子信标探针的3 ’端修饰有淬灭基团， 选自BHQ1、 BHQ2、 Dabcy1、 TAMRA、 MGB、 E CLIPSE中的一种或多种。 4.权利要求1 ‑3任一项所述引物组合在检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性中的应用， 其 特征在于， 包括以待测样本的DNA为模板， 利用所述引物组合进行等温扩增和熔解曲线检 测。 5.权利要求1 ‑3任一项所述引物组合在制备检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的试剂中 的应用。 6.一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑3任一 项所述的引物组合、 Bst  DNA聚合酶和含dNTPs的反应液。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述含dNTPs的反应液包括dNTPs、 Tris ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480683 A 2HCl、 KCl、 (NH4)2SO4、 MgSO4、 Triton X‑100； 优选地， 所述含dNTPs的反应液中， 所述dNTPs的浓度为3 ‑5mM； 优选地， 所述含dNTPs的反应液中， 所述(NH4)2SO4的浓度为30 ‑40mM， 所述MgSO4的浓度为 20‑30mM， 所述KCl的浓度为30 ‑40mM， 所述Triton  X‑100的浓度为0.2％ ‑0.5％， 所述Tris ‑ HCl的浓度为6 0‑70mM； 所述Tris ‑HCl的pH为8 ‑8.8。 8.如权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括阳性质控 品和阴性质控 品； 优选地， 所述阳性质控品为野生型结核分枝杆菌、 或者含有野生型katG基因和野生型 inhA基因的核酸序列的T载体克隆； 所述阴性质控品为去离 子水。 9.一种结核分枝杆菌异烟肼耐药性的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)从待测样本中提取DNA； (2)以步骤(1)提取得到的DNA作为模板， 利用权利要求1 ‑3任一项所述的引物组合或权 利要求6‑8任一项所述的试剂盒进行等温扩增 和熔解曲线检测。 10.如权利要求9所述的检测方法， 其特征在于， 所述等温扩增的反应条件包括： 于63℃ 反应40‑50min； 所述熔解曲线检测的反应条件包括： 95℃， 1min， 40℃， 2min， 升温过程40℃～85℃， 升 温速率0.1℃/s， 进行荧 光信号采集。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480683 A 3