(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210081886.1 (22)申请日 2022.01.24 (71)申请人 东南大学 地址 210096 江苏省南京市玄武区新 街口 街道四牌楼 2号 (72)发明人 葛峥　訾杰　顾岩　随敏　韩旗　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 代理人 何静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的 引物组合及方法 (57)摘要 本发明公开一种检测恶性血液病IKZF家族 基因突变的引物组合及方法， 所述方法包含采用 多重PCR建库、 高通量测序技术对恶性血液病患 者进行IKZF1 ‑5基因靶向外显子测序筛查。 公开 了包括71对引物序列及组合用于IKZF 1‑5基因外 显子检测。 本发明具有检测范围全面、 准确度及 灵敏度高、 特异性强的优点。 检测所需患者的DNA 量低， 一次采血或骨髓穿刺即可满足需求， 临床 可操作性强， 能快速、 精准的检测恶性血液病患 者的IKZF家族基因突变， 应用于临床精准分型诊 断、 早期筛查高危亚型、 预后评估和精准个体化 靶向治疗指导。 权利要求书2页 说明书15页 序列表26页 附图5页 CN 114317759 A 2022.04.12 CN 114317759 A 1.一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合， 其特征在于， 包括IKZF1 ‑5基因 外显子测序的71对引物， 分为两个引物池， 36对引物组成第一个引物池M1， 35对引物组成第 二个引物池M2。 2.根据权利要求1所述的一种检测恶性血液病IKZF家族基因突变的引物组合， 其特征 在于， 所述M1引物池序列包括M1 ‑1f～M1‑36f和M1‑1r～M1‑36r， M2引物池序列包括M2 ‑1f～ M2‑35f和M2‑1r～M2‑35r。 3.根据权利要求1所述的引物 组合检测IKZF家族基因突变的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： S1、 恶性血 液病患者单个核细胞的分离； S2、 细胞基因 组DNA的提取； S3、 DNA文库构建， 测序。 4.根据权利 要求3所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法， 其特征在于， 所述S3 的操作步骤 包括： S3.1确认IKZF1 ‑5基因外显子PCR扩增子序列； S3.2准备并定量PCR扩增模板 S3.2.1将试剂盒置 于室温； S3.2.2配制工作液； S3.2.3向分析 管中加入配制的工作液190 μL； S3.2.4在分析管中分别加入dsDNA  standard#1、 standard#2和稀释的dsDNA样本， 并标 记； S3.2.5室温避光孵 育； S3.2.6检测样本浓度； S3.3基因特异性PCR 配制PCR扩增反应 体系， 混匀并置 于PCR仪上运行 S3.4回收第一轮扩增产物 S3.4.1将磁珠置 于室温中， 充分轻柔混匀； S3.4.2加入磁珠与反应液混合， 轻柔吹吸混匀， 室温孵 育； S3.4.3将EP管放置在磁力架上至液体澄清， 吸弃 上清； S3.4.4将EP管保持在磁力架上， 加入80％乙醇， 室温放置 30秒， 弃上清； S3.4.5重复上一 步用80％乙醇洗一次； S3.4.6将EP管保持在磁力架上干燥， 观察磁珠表面 不再反光即可； S3.4.7将EP 管从磁力 架上取下， 加入Nuclease ‑free水， 轻柔吹打混匀， 室温放置2min， 再将EP管放置在磁力架上至液体澄清； S3.4.8吸取 上清至新PCR管， 标记； S3.5 Qubit 3.0对回收产物定量； S3.6接头连接 配制第二轮PCR反应 体系， 合成PCR接 头引物； S3.7.混匀后离心， 置 于PCR仪上运行； S3.8文库纯化权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114317759 A 23.8.1将磁珠置 于室温中， 充分轻柔混匀； 3.8.2加入磁珠与反应液混合， 轻柔吹吸混匀， 室温孵 育； 3.8.3将EP管放置在磁力架上至液体澄清， 吸弃 上清； 3.8.4将EP管保持在磁力架上， 加入80％乙醇， 室温放置 30秒， 弃上清； 3.8.5重复3.8.4 步骤用80％乙醇洗一次； 3.8.6将EP管保持在磁力架上干燥， 观察磁珠表面 不再反光即可； 3.8.7将EP管从磁力架上取下， 加入Nuclease ‑free水， 轻柔吹打混匀， 室温放置2min， 再将EP管放置在磁力架上至液体澄清； 3.8.8吸取 上清至新PCR管； 3.9Qubit定量产物浓度； 3.10送测序 获得的产物即是测序用的文库； 不同样品之间等摩尔量混合后， 即可进行Illumina测 序。 5.根据权利要求4所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法， 其特征在于， 所述 S3.3中PCR扩增反应体系试剂包 括Gene‑specific  PCR Master Mix1、 PanelA /B、 稀释的DNA 模板和双蒸水。 6.根据权利要求5所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法， 其特征在于， 所述 PanelA/B的反应 体系需分开配制。 7.根据权利要求4所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法， 其特征在于， 所述 S3.6中PCR扩增反应体系试剂包括2x  Indexing  PCR MasterMix2、 i5 ‑primer接头、 i7 ‑ primer接 头、 纯化PCR产物和Nuclease ‑free水。 8.根据权利要求4所述的引物组合检测IKZF家族基因突变的方法， 其特征在于， 所述 PCR接头引物包括 i5 index和i7 index。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114317759 A 3