(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210081426.9 (22)申请日 2022.01.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114250317 A (43)申请公布日 2022.03.29 (73)专利权人 天津市水产研究所 地址 300221 天津市河西区解 放南路442号 (72)发明人 罗璋　刘厚孚　徐晓丽　丁子元　 宋昀鹏　张连英　 (74)专利代理 机构 北京睿智保诚专利代理事务 所(普通合伙) 11732 专利代理师 周新楣 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01)(56)对比文件 CN 112501039 A,2021.0 3.16 CN 112210619 A,2021.01.12 徐晓丽等.中华绒螯蟹“牛奶病”病原及其 致 病性研究. 《中国海 洋大学学报》 .2021,第51卷 (第12期),第23 -32页. 马红丽等.辽宁地区中华 绒螯蟹“牛奶病”的 病原分离与鉴定. 《大连海 洋大学学报》 .2020,第 35卷(第5期),第714-718页. Hongli Ma等.Metsc hnikowia bicuspidata isolated from mi lky diseased Eri ocheir sinensis: Phen otypic and genetic characterizati on,antifung al susceptibi lity and c hallenge models. 《J Fish Dis》 .2021,第45卷(第1期),第41-49页. 审查员 李玲玲 (54)发明名称 一种用于检测二尖梅奇酵母的引物组和试 剂盒 (57)摘要 本发明属于病原菌检测技术领域， 提供了一 种用于检测二尖梅奇酵母的引物组和试剂盒。 所 述引物组包括上游检测引物和下游检测引物； 所 述上游检测引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所 示， 所述下游检测引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO:2所示。 本发明所述含有检测引物的试剂盒具 有灵敏度高、 特异性强、 检测准确度高的优点， 能 够有效检出二尖梅奇酵母， 方法简便， 与二尖梅 奇酵母相邻物种无交叉反应， 也与其他常见水产 动物病原菌无交叉反应， 对于水产动物的疾病防 控具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 114250317 B 2022.09.16 CN 114250317 B 1.一种用于检测二尖梅奇酵母的引物组， 其特征在于， 包括上游检测引物和下游检测 引物； 所述上游检测引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 所述下游检测引物的核苷 酸序 列如SEQ ID NO:2所示。 2.一种用于检测二尖梅奇酵母的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的引物组和 检测试剂。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂包括2 ×Taq MasterMix和 无菌水。 4.根据权利要求2所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述引物 组中上游检测引物和下游检测 引物的使用浓度独立 为8～12mM 。 5.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 应用所述试剂盒检测时的扩增体系， 以 50 μL计， 包括以下组分： 2 ×Taq MasterMix  25 μL， 上游检测引物0.5 μL， 下游检测引物0.5 μ L， 模板1 μL， 无菌水23 μL。 6.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 应用所述试剂盒检测时的扩增程序为： 94℃预变性10min； 94℃变性1min， 62℃退火1min， 72℃延伸30s， 变性、 退火、 延伸进行35个 循环后； 72℃最终延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114250317 B 2一种用于 检测二尖梅奇酵母的引物组和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及病原菌检测技术领域， 尤其涉及一种用于检测二尖梅奇酵母的引物组 和试剂盒。 背景技术 [0002]二尖梅奇酵母是一种致病性酵母菌， 能引起中华绒螯蟹、 罗氏沼 虾、 大鳞大马哈鱼 等多种水产动物病害。 目前， 以引起中华绒 螯蟹病害 尤为严重。 患病蟹的主要症状为反应迟 钝、 围心腔内可见大量白色乳状液体， 养殖户称其为 “牛奶病”。 该病引起中华绒 螯蟹大量死 亡， 严重时发病率可达90％， 死亡率超过50％， 造成重大经济损失。 目前， 对 该病尚无有效的 治疗措施。 [0003]开展早期检测， 选择不携带二尖梅奇酵母的中华绒螯蟹进行养殖是预防该疾病的 有效办法。 但目前检测方法还不完善， 主要还是依靠微生物培养的方法进 行检测， 该方法耗 时长， 通常需要3天以上。 在现有技术中， 中国专利202011134597.0公开了一种二尖梅奇酵 母的PCR检测方法， 在灵敏度方面， 该方法检测二尖梅奇酵母的最低限度为8.62 ×10个/ μL； 在特异性方面， 检测发现与罗伊氏乳杆菌、 保加利亚乳杆菌、 嗜热链球菌、 植物乳杆菌、 干酪 乳杆菌、 纳豆芽孢杆菌、 金黄色葡萄球菌、 霍乱弧菌、 恶臭假单胞菌、 酿酒酵母、 近平滑假丝 酵母菌、 季也蒙毕赤酵母、 生丝 毕赤酵母、 长孢洛德 酵母、 芽枝状枝孢霉、 木贼镰刀菌均无特 异性反应。 [0004]评价PCR检测方法的优 劣， 灵敏度和特异性是主要指标。 灵敏度 越高、 特异性越强， 表明效果越好。 现有技术中建立的PCR检测方法， 在灵敏度方面， 最低检测限度(灵敏度)还 有提升的空间。 在特异 性方面， 虽然发现与较多二尖梅奇酵母的邻近种都无 交叉反应， 但 根 据报道， 其他病原， 例如溶藻弧菌、 哈维氏弧菌(黄增荣 .三疣梭子蟹(Portunus   tritubercularus) “牛奶病”病原的鉴定及其组织病理学研究[D].西北农林科技大学, 2006.)， 也能引起蟹类 “牛奶病”， 现有技术中建立的方法没有测定是否与这些病原存在 交 叉反应。 此外， 河蟹主要生活在水中， 会经常受到水产养殖动物病原的侵袭， 现有技术中建 立的方法也没有测定与常见水产养殖动物病原(如柱状黄杆菌、 嗜水气单胞菌、 温和气单胞 菌、 维氏气单胞菌、 无乳链球菌、 停乳链球菌、 荧光假单胞菌)是否存在交叉反应。 因此， 该方 法还可以被进一 步的改进和提升 。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种用于检测二尖梅奇酵母的引物组和试剂盒， 所述试剂 盒具有灵敏度高、 特异性强、 检测准确度高的优点， 能够有效检测出二尖梅奇酵母， 方法简 便， 与二尖梅奇酵母相 邻物种无 交叉反应， 也与其他常见水产动物病原菌无 交叉反应， 对于 水产动物的疾病防控具有重要意 义。 [0006]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： [0007]本发明提供了一种用于检测二尖梅奇酵母的引物组， 包括上游检测引物和下游检说　明　书 1/7 页 3 CN 114250317 B 3