(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210085264.6 (22)申请日 2022.01.25 (71)申请人 浙江农林大 学 地址 310000 浙江省杭州市临安区武肃街 666号 申请人 浙江省粮食局直属粮油储备库 (72)发明人 刘兴泉　胡浩　崔杰　周海芳　 郑晶　丁明全　 (74)专利代理 机构 浙江新篇律师事务所 3 3371 代理人 张冬尧 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G16B 20/20(2019.01) G16B 25/20(2019.01) G16B 30/10(2019.01) G16B 40/10(2019.01) G16B 50/10(2019.01) G16B 50/30(2019.01) (54)发明名称 水稻耐储基因挖掘与分子标记开发 (57)摘要 本发明公开了水稻耐储基因挖掘与分子标 记开发， 包括以下步骤： S1、 稻谷种质资源收集： 选取长江中下游的主要稻谷品种材料56份， 其中 包含籼稻25中， 粳稻31种； S2、 陈化处理： 以未经 陈化的样品为对照， 记为CK； 在恒温恒湿箱(37 ℃、 85％RH)中加速陈化5周， 7周的样品， 分别记 为CD5， CD7， 同时， 对 不同处理下的样品的发芽率 等数量性状进行测定。 通过采用本发 明设计的检 测方法能够根据鉴定到的耐储基因SNP设计了 KASP分子标记， 便于 未来开发鉴定耐储品种的检 测试剂盒， 可通过筛选耐储的稻谷基因型、 培育 品质耐储的新基因型， 种植适于储藏、 品质更佳 的稻谷品种， 从而实现粮食储藏的精准调控， 对 减少储粮损失、 保证储粮质量具有重要意 义。 权利要求书3页 说明书5页 附图1页 CN 114350845 A 2022.04.15 CN 114350845 A 1.水稻耐储基因挖掘与分子标记开发， 其特 征在于： 包括以下步骤： S1、 稻谷种质资源收集： 选取长江中下游的主 要稻谷品种材 料56份， 其中包 含籼稻25中， 粳稻31种； S2、 陈化处 理： 以未经陈化的样品为对照， 记为CK； 在恒温恒湿箱(37℃、 85％RH)中加速 陈化5周， 7周 的样品， 分别记 为CD5， CD7， 同时， 对不同处理下的样品的发芽率、 脂肪酸值、 丙二醛含量、 电 导率等数量性状进行测定； S3、 耐储表型鉴定： 对水稻样品的DNA进行提取， DNA样品经检测合格后进行文库构建， 库检合格后上机测 序， 采用Illumina  HiSeq/MiSeqe测序， 测序得到的原始序列 数据通过FASTQ进行测序数据 质控分析， 通过Hisat2软件将测序过滤后数据与参考基因组粳稻品种日本晴比对， 利用 GATK软件完成对群体内样本的SNP检测开发， 采用Plink软件， 剔除最小等位基因频率＜ 5％， 缺失率＞20％的基因标记SNP， 共筛选高质量SNP标记353196个用于接下来的表型关联 分析； S4、 全基因 组关联分析(GWAS)和转录组分析： (1)采用Gemma软件， 选择单变量的混合线性模型， 结合样品间亲缘关系分析结果， 筛选 显著关联的SNP位 点； (2)对三个环境下的表型数据分别进行关联分析， 以检测在不同点稳定出现的耐储位 点； (3)显著关联SNP位点的阈值P ‑value为10 ‑4， 关联分析所用的SNP总数为254815个(本 试验总开发353196个SNP)， 根据日本晴基因组的GFF3注释文件， 对SNPs的功能进行注释， 采 用Halpoview软件联合表型 数据对目标候选基因进行 单倍型分析； (4)显著关联SNP位点： 经关联分析发现， 全基因组范围内稻谷基因型发芽率共关联到 2071个SNP位点， 其中在6号和8号染色体的关联区域上有强信号， 8号染色体上1.2MB ‑1.5MB 区域有多个SNP位点超过阈值， 全基因组范围内稻谷基因型脂肪酸性状共关联到510个SNP 位点， 其中关联区域在1号、 7号和9号染色体上有强信号， 1号染色体和9号染色体信号显示 有极强关联信号， 全基因组范围内稻谷基因型丙二醛性状共关联到4034个SNP位点， 其中在 1， 3， 4， 5， 8号染色体上都有极强关联信号， 全基因组范围内稻谷基因型电导率性状共关联 到1510个SNP位 点， 其中1号2号染色体出现极强关联信号； (5)依据表型 数据选取4个具有极端耐储性的稻谷基因型进行转录组测序； (6)耐储基因型： 秀水134和浙粳96； 不耐储基因型南粳9108和苏秀867， 采用Trizol法 提取陈化前后稻谷粉末中总RNA， 并对RNA样品进行严格质控： 通过琼脂糖凝胶电泳分析样 品RNA完整性及是否存在DNA污染； 采用NanoPhotometer检测RNA纯度； 再以Qubit2.0、 Agilent 2100精确定量RNA浓度、 完整性， RNA质检合格后上机测序， 总计获得raw  data  300G， 以日本晴基因组作为参考基因组， 选用Hisat2软件进行比对， 利用R包Deseq2统计差 异表达基因， 对比水稻基因 组注释项目数据库， 总共注释差异基因1 1039个； (7)结合转录组结果， 本试验分析了GWAS筛选得到的14个耐储候选基因的表达模式， 发 现其中三个基因LOC_Os06g09450.8、 LOC_Os01g45060.1、 LOC_Os01g47350.1分别编码蔗糖 合酶、 多聚半乳糖醛酸酶、 烯酰辅酶A水合酶异构酶家族蛋白， 在耐储与不耐储基因型中表权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114350845 A 2达量差异明显， 耐储基因型可能通过上调表达L OC_Os06g09450.8、 LOC_Os01g45060.1， 为胁 迫反应提供能量； (8)显著差异基因： 不耐储基因型中基因正常表达， 在LOC_Os01g45060、 LOC_ Os01g47350和LOC_Os06g09450基因的内部共发现和耐储形状关联的位点7个(chr1_ 25581596、 chr1_27054464、 chr6_4796306、 chr6_4800231、 chr6_4802745、 chr6_4802754、 chr6_4802768)， 在LOC_Os01g45060上游1000bp范围内挖掘到关联位点一个(chr1_ 25579324)； S5、 耐储候选基因筛 选： 在耐储性状相 关联的3个基因附近共发现强关联SNP位点8个， 以这个8个位点为依据， 共开发相应的荧光分子标记8对， 结合竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive  Allele  Specific  PCR， KASP)技术， 对不同品种的水稻基因组DNA样品中关联到的SNPs进行进一步 的验证和分型； S6、 通用荧 光引物设计： KASP需要准备： (1)两条末端碱基不 同的等位基因正向引 物与一条反向引 物构成的Primer  Mix， 两条 正向引物5 ’端分别连有不同序列的检测引物序列； (2)带有不同荧 光的两条检测引物Master  Mix； 3)DNA模板； KASP反应在LightCycler480(LC480)上进行， PCR扩增反应体系和反应程序参照韦 宇等 [25]的方法： 将稀释好的DNA模板50—100ng ·μL‑1， 分别加入96孔板中， 配制如下反应体系进行PCR 扩增反应： 模板DNA 5 μL， 2×KASP Master mix5 μL， KASP标记引物0.14 μL， 每个孔的反应体系 总体积为10.14 μL； 在LightCycler  480(LC480)上的PCR反应程序为： (1)KASP热循环： 94℃预变性15min； 94℃变性20s； 61—55℃退火延伸60s， 10个循环(每 个循环降低0.6℃)； 94℃变性20s； 5 5℃退火延伸6 0s， 26个循环； 37℃读取1mi n； (2)KASP回收： 94℃变性20s； 57℃延伸60s， 重复步骤(1)—(2)两次(共3次)； 37℃读取 1min； (3)反应结束后， 根据检测的2种荧光信号来判断样本分型情况， 不同的荧光信号获得 不同的基因型； (4)开发分子标记序列：权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114350845 A 3