(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210085433.6 (22)申请日 2022.01.25 (71)申请人 中国农业科 学院生物技 术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 苗朝华　金芜军　刘卫晓　宛煜嵩　 董美　高进　黄卫红　王迪　 文婷婷　孟丽霞　 (74)专利代理 机构 北京知汇林知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11794 代理人 董涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 转基因玉米BFL4-2转化体特异性实时荧光 定量PCR检测引物、 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种转基因玉米BFL4 ‑2转化 体特异性定量PCR检测引物、 检测方法。 特异性引 物对为： BFL4 ‑2‑qF， 其核苷酸序列如序列表SEQ   ID No.1所示； BFL4 ‑2‑qR， 其核苷酸序列如序列 表SEQ ID No.2所示。 特异性探针为： BFL4 ‑2‑P， 其序列如序列表SEQ  ID No.3。 采用本发明的引 物对与探针进行实时荧光定量PCR反应， 可以鉴 定样品中是否含有转基因玉米BFL4 ‑2品系， 并能 对其含量进行准确定量。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图4页 CN 114410822 A 2022.04.29 CN 114410822 A 1.一种转基因玉米BFL4 ‑2转化体特异性定量PCR检测引物， 其特征在于， 所述特异性检 测正向引物为： BFL4 ‑2‑qF， 其核苷酸序列如序列表SEQ  ID No.1所示； 反向引物为： BFL4 ‑2‑ qR， 其核苷酸序列如序列表SEQ  ID No.2所示。 2.根据权利 要求1所述的转基因玉米B FL4‑2转化体特异性定量PCR检测引物， 与 其匹配 的探针为： BFL 4‑2‑P， 探针序列如序列表SEQ  ID No.3所示。 3.一种转基因玉米BFL4 ‑2转化体特异性的定量检测方法， 其特征在于， 按照如下步骤 进行： (1)提取待测样品DNA； (2)以提取的水稻样品 的DNA为模板， 同时设置玉米内标准基因和转基因玉米B FL4‑2转 化体特异性实时荧 光定量PCR反应 体系， 对标准梯度样品和待测样品进行检测； (3)运行实时荧光定量PCR反应， 若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体系没 有扩增信号出现， 则证明待测样品中不含有转基因玉米BFL 4‑2品系； (4)若转化体特异性实时荧光PCR反应体系扩增出荧光信号， 则证 明样品中含有转基因 玉米BFL4 ‑2， 根据标准梯度样品读取的荧光PCR反应的Ct值， 以Ct值为Y轴， 基因组DNA拷贝 数的对数为X轴， 绘制标准曲线Ct＝k ×Lg(Copies)+b， 分别得到一条外源基因标准曲线方 程和一条内标准基因标准曲线 方程， 再将待测样品的Ct 值带入方程即得到了外源基因和内 标准基因的拷贝数， 然后按下述公式计算转基因含量： 样品中转基因玉米BFL4 ‑2的含量％ ＝外源基因拷贝数/内标准基因拷贝数 ×100。 4.根据权利 要求3所述的转基因玉米BFL4 ‑2转化体特异性定量检测方法， 其特征在于， 所述BFL4 ‑2水稻转化体特异性实时荧光PCR反应体系为： 无菌水8 μL， 2 ×TaqMan反应缓冲液 12.5 μL， 10 μmol/L  BFL4‑2‑qF1 μL， 10 μmol/L  BFL4‑2‑qR1 μL， 10 μmol/L  BFL4‑2‑P0.5 μL， DNA 模板2 μL。 5.根据权利 要求3所述的转基因玉米BFL4 ‑2转化体特异性定量检测方法， 其特征在于， 所述实时荧 光PCR反应的条件为： 95℃， 5mi n； 95℃， 15s， 6 0℃， 60s， 40个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410822 A 2转基因玉米B FL4‑2转化体特异性实时荧光定量PCR检测引物、 检测方法 技术领域 [0001]本发明涉及一种转基因材料的定量检测引物， 特别涉及一种转基因玉米BFL4 ‑2转 化体特异性实时荧 光定量PCR检测引物及其检测方法。 背景技术 [0002]随着转基因作物在全球的种植面积不断扩大， 转基 因产品的安全性问题引起了世 界各国普遍的关注。 近年来， 关于转基因产品的安全性事件报道不断， 尽管有 些报道缺乏事 实依据， 但却更加引起了公众的重 视和担忧， 而我国尚未建立 转基因产品标识制度。 [0003]目前， 转基因检测主要有两个大类： 一种是在核酸水平上进行检测， 另一种是在蛋 白质水平上进 行检测。 在 核酸水平上进行检测通常以DNA 为模板采用P CR的基础方法进 行检 测。 在应用P CR技术进 行转基因作物定性检测时， 根据其特异 性， 将其分为筛选检测法、 基因 特异性方法、 构建特异 性方法和转化体特异 性方法。 转化体特异 性方法是通过检测外源DNA 与染色体连接区的序列来 实现的。 由于连接区序列的特异 性， 因而该方法准确性高， 最适用 于转基因产品检测。 [0004]实时荧光定量PCR具有灵敏度高、 特异性好和可靠性强的特点， 既可以避免定性 PCR假阳性现象， 又可以对样品中转基因含量进行定量， 因而在转基因检测中具有广阔前 景。 转基因玉米BFL4 ‑2是由中国农业科学院生物技术研究所研发的抗虫耐 除草剂玉米， 抗 草甘膦、 抗鳞翅目昆虫， 目前已进入生产性试验阶段， 具有极高的产业化应用潜力。 迄今为 止， 国内外还没有用于转基因玉米BFL4 ‑2定量PCR检测的方法， 制定转基因玉米BFL4 ‑2转化 体特异性实时荧光定量PCR检测方法对于我国转基因生物安全监管、 促进我国玉米产业的 健康发展具有重要意 义。 发明内容 [0005]本发明的目的之一是提供用于检测转基因玉米BFL4 ‑2的转化体特异性实时荧光 定量PCR检测引物和探针； 所述特异性检测正向引物 为： BFL4‑2‑qF， 其核苷 酸序列如序列表 SEQ ID No.1所示； 反向引物为： BFL 4‑2‑qR， 其核苷酸序列如序列表SEQ  ID No.2所示。 [0006]与其匹配的探针为： BFL 4‑2‑P， 探针序列如序列表SEQ  ID No.3所示。 [0007]本发明的目的之二是建立一种转基因玉米BFL4 ‑2的转化体特异性实时荧光定量 PCR定量方法； [0008]本发明的上述目的是通过以下技 术方案来实现的： [0009](1)提取待测样品DNA； [0010](2)以提取的水稻样品的DNA为模板， 同时设置玉米内标准基因和转基因玉米 BFL4‑2转化体特异性实时荧 光定量PCR反应 体系， 对标准梯度样品和待测样品进行检测； [0011](3)运行实时荧光定量PCR反应， 若待测样品中转化体特异性实时荧光PCR反应体 系没有扩增信号出现， 则证明待测样品中不含有转基因玉米BFL 4‑2品系；说　明　书 1/6 页 3 CN 114410822 A 3