(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210085219.0 (22)申请日 2022.01.25 (71)申请人 全国畜牧总站 地址 100125 北京市朝阳区麦 子店街20号 楼 (72)发明人 洪军　高秋　王显国　刘芳　 林积圳　吴菲菲　李玉荣　张义　 王梅娟　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 闫书宁 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种鉴定野豌豆属品种真实性的方法及其 专用SSR引物组合 (57)摘要 本发明公开了一种鉴定野豌豆属品种真实 性的方法及其专用SSR引物组合。 本发明提供的 SSR引物组合由5个引物对组成， 每个引物对由2 条引物序列组成， 5个引物对中各个引物的核苷 酸序列依次如SEQ  ID NO:1至SEQ  ID NO:10所 示。 本发明提供的SSR引物组合可用于对野豌豆 属品种在种子或幼苗期进行早期鉴定， 保证品种 的真实性， 切实保护生产者和育种家的权益。 本 发明提供的方法具有准确、 低成本、 操作简单、 节 约人力、 物力等优点， 具有十分广阔的应用前 景。 权利要求书4页 说明书11页 序列表2页 附图23页 CN 114525355 A 2022.05.24 CN 114525355 A 1.鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的引物组合， 为引物 组合2或引物组合1； 引物组合2由引物对VA42、 引物对VA100、 引物对VA107、 引物对VA114和引物对VA118组 成； 引物对VA42由SEQ  ID NO:1所示的单链DNA分子和SEQ  ID NO:2所示的单链DNA分子组 成； 引物对VA100由SEQ  ID NO:3所示的单链DNA分子和SEQ  ID NO:4所示的单链DNA分子组 成； 引物对VA107由SEQ  ID NO:5所示的单链DNA分子和SEQ  ID NO:6所示的单链DNA分子组 成； 引物对VA114由SEQ  ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ  ID NO:8所示的单链DNA分子组 成； 引物对VA118由SEQ  ID NO:9所示的单链DNA分子和SEQ  ID NO:10所示的单链DNA分子组 成； 引物组合1由引物组VA42、 引物组VA100、 引物组VA107、 引物组VA114和引物组VA118组 成； 引物组VA42由所述引物对VA42和荧光标记甲修饰的引物M13组成； 引物组VA100由所述 引物对VA100和荧光标记乙修饰的引物M13组成； 引物组VA107由所述引物对VA107和荧光标 记丙修饰的引物M13组成； 引物组VA114由所述引物对VA114和荧光标记 丁修饰的引物M13组 成； 引物组V A118由所述引物对V A118和荧光标记戊修饰的引物M13组成； 所述引物M13的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1自5’末端起第1 ‑19位所示； 荧光标记甲、 荧光标记乙、 荧光标记丙、 荧光标记丁和荧光标记戊可以发出相同的荧 光， 也可以发出不同的荧 光； 所述9种野豌豆属国审品种为江淮、 凉山、 公农、 兰箭2号、 川北、 兰箭3号、 清水河、 延边 和333/A。 2.用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法， 包括如 下步骤： 以待测野豌豆的基因组DNA为模板， 分别采用权利要求1中引物对VA42、 引物对 VA100、 引 物对VA107、 引物对VA114和引 物对VA118进行PCR扩增， 然后依次按照(标准a1)、 (标准a2)、 (标准a3)、 (标准a4)和/或(标准a5)进行判断： (标准a1)采用引物对V A42进行PCR扩增： 如果仅得到182bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为凉山； 如果仅得到208bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、 兰箭3号、 清水河或 333/A； 如果得到1 12bp和134bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为川北； 如果得到210bp和214bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为延边； (标准a2)采用引物对V A100进行PCR扩增： 如果仅得到232的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为江淮； 如果仅得到248的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为凉山； 如果仅得到238的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为兰箭2号、 川北、 兰箭3号、 清水河 或333/A； (标准a3)采用引物对V A107进行PCR扩增： 如果仅得到448bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为江淮、 兰箭2号、 川北、 兰箭3 号、 清水河或3 33/A； 如果仅得到252bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为公农；权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114525355 A 2如果仅得到25 0bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为延边； (标准a4)采用引物对V A114进行PCR扩增： 如果仅得到14 4bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为江淮或3 33/A； 如果仅得到240bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为 为公农或延边； 如果得到144bp和152bp的扩增产物， 则 待测野豌豆为或候选为兰箭2号、 川北、 兰箭3号 或清水河； (标准a5)采用引物对V A118进行PCR扩增： 如果得到218bp和238bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为江淮或清水河； 如果得到218bp和258bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为兰箭2号； 如果得到218bp和248bp的扩增产物， 则待测野豌豆为或候选为川北、 兰箭3号或3 33/A； 所述9种野豌豆属国审品种为江淮、 凉山、 公农、 兰箭2号、 川北、 兰箭3号、 清水河、 延边 和333/A。 3.如权利要求2所述的方法， 其特 征在于： 所述PCR扩增产物通过电泳检测或测序检测。 4.用于鉴定待测野豌豆为或候选为9种野豌豆属国审品种中的哪一种的方法， 包括如 下步骤： 以待测野豌豆的基因组DNA为模板， 分别采用权利要求1中引物组VA42、 引物组 VA100、 引物组VA107、 引物组VA114和引物组VA118 进行PCR扩增， 之后将PCR扩增产物进行毛 细管电泳检测， 按照(标准b1)、 (标准b2)、 (标准b3)、 (标准b4)和/或(标准b5)进行判断： (标准b1)采用引物组V A42进行PCR扩增： 如果得到峰值 为182的扩增产物， 则野豌豆品种为凉山； 如果得到峰值 为208的扩增产物， 则野豌豆品种为兰箭2号、 兰箭3号、 清水河或3 33/A； 如果得到峰值 为112和134的扩增产物， 则野豌豆品种为川北； 如果得到峰值 为210和214的扩增产物， 则野豌豆品种为延边； (标准b2)采用引物组V A100进行PCR扩增： 如果得到峰值 为232的扩增产物， 则野豌豆品种为江淮； 如果得到峰值 为248的扩增产物， 则野豌豆品种为凉山； 如果得到峰值为238的扩增产物， 则野豌豆品种为兰箭2号、 川北、 兰箭3号、 清水河或 333/A； (标准b3)采用引物组V A107进行PCR扩增： 如果得到峰值为448的扩增产物， 则野豌豆品种为江淮、 兰箭2号、 川北、 兰箭3号、 清水 河或333/A； 如果得到峰值 为252的扩增产物， 则野豌豆品种为公农； 如果得到峰值 为250的扩增产物， 则野豌豆品种为延边； (标准b4)采用引物组V A114进行PCR扩增： 如果得到峰值 为144的扩增产物， 则野豌豆品种为江淮或3 33/A； 如果得到峰值 为240的扩增产物， 则野豌豆品种为公农或延边； 如果得到峰值为144和152的扩增产物， 则 野豌豆品种为兰箭2号、 川北、 兰箭3号或清水 河； (标准b5)采用引物组V A118进行PCR扩增： 如果得到峰值 为218和238的扩增产物， 则野豌豆品种为江淮或清水河；权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 114525355 A 3