(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210085448.2 (22)申请日 2022.01.25 (71)申请人 基诺莱 （重庆） 生物技 术有限公司 地址 401334 重庆市沙坪坝区大 学城中路 61号重庆医科大学缙云校区兰苑楼 SQ0016 (72)发明人 张钧　李浩男　 (74)专利代理 机构 北京天悦专利代理事务所 (普通合伙) 11311 代理人 田明　任晓航 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种易栓症基因突变的多重PCR检测方法和 试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种易栓症基因突变的多重PCR 检测方法和检测盒， 方法包括以下步骤： 获取待 检测基因第一轮扩增产物； 使用接头引物对获得 的扩增产物进行第二轮扩增， 对获得的文库进行 测序； 对获得的测序结果进行分析， 实现全编码 区的突变检测。 本发明对待检测样品的起始量要 求低， 可对血浆和血清中的极低DNA样品进行分 析； 可实现全编码区基因突变检测， 能发现新的 基因突变； 检测灵敏度高， 检测时间短， 结合高通 量测序技术， 可短时间内实现全编码区突变检 测。 权利要求书2页 说明书25页 序列表13页 附图1页 CN 114369657 A 2022.04.19 CN 114369657 A 1.一种易栓症基因突变的多重PCR检测方法， 其特 征是， 所述方法包括以下步骤： 步骤一、 获取待检测基因第一轮扩增产物； 步骤二、 使用接头引物对步骤一获得的扩增产物进行第 二轮扩增， 其中， 所述接头引物 的上游引物SEQ  ID NO.3的碱基序列为： “AATGATACG GCGACCACCGAGATCTACACGAGCTCA AACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCT”； 下游引物SEQ  ID NO.4的碱基序列为： “CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATGCGAGTGACTG GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA”； 步骤三、 对步骤二获得的文库进行测序； 步骤四、 对步骤三获得的测序结果进行分析， 实现全编码区的突变 检测。 2.如权利要求1所述的易栓症基因突变的多重PCR检测方法， 其特征是： 步骤一包括使 用609对引物对所述待检测基因进行扩增， 所述609对引物为具有SEQ  ID No 5‑SEQ ID No  1327所示序列或其同源序列。 3.如权利 要求2所述的易栓症基因突变的多重PCR检测方法， 其特征是： 所述609对引物 包括第一套引物对与第二套引物对； 所述第一套引物对为具有SEQ  ID N0.5‑SEQ ID NO.719所示序列或其同源序列； 所述第二套引物对为具有SEQ  ID N0.720‑SEQ ID NO.1327所示序列或其同源序列。 4.如权利要求3所述的易栓症基因突变的多重PCR检测方法， 其特征是： 序列SEQ  ID  N0.5‑SEQ ID NO.1327相邻序列号的引物两 两配对形成6 09对引物。 5.如权利要求3所述的易栓症基因突变的多重PCR检测方法， 其特征是： 每个上游引物 的5'端添加序列SEQ  ID N0.1： “ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCT”； 每个下游引物的5'端添加序列SEQ  ID N0.2： “GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA”。 6.如权利要求1所述的易栓症基因突变的多重PCR检测方法， 其特征是： 所述步骤二包 括对所述 步骤一获得的产物进行 纯化回收， 对纯化回收后的扩增产物进行第二轮扩增。 7.如权利要求3所述的易栓症基因突变的多重PCR检测方法， 其特征是： 所述方法检测 基因包括： SERPINC1、 PROS1、 PROC、 F2、 F5、 F8、 F9、 F12、 PLG、 THBD、 PROCR、 ADAMTS13、 TFPI、 SERPIND1、 MTHFR， FGA、 FGB、 FG G、 PLAT、 SERPI NE1。 8.一种易栓症基因突变的多重PCR检测盒， 其特征是， 所述检测盒包括引物SEQ  ID  NO.3， 碱基序列为： “AATGATACG GCGACCACCGAGATCTACACGAGCTCA AACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT TCCGATCT'； 引物SEQ ID NO.4， 碱基序列为： “CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATGCGAGTGACTG GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA”。 9.如权利要求8所述的一种易栓症基因突变的多重PCR检测盒， 其特征是： 所述检测盒 还包括609对引物， 所述609对引物为具有SEQ  ID No 5‑SEQ ID No 1327所示序列或其同源 序列。 10.如权利要求9所述的一种易栓症基因突变的多重PCR检测盒， 其特征是： 所述609对 引物包括第一套引物对与第二套引物对； 所述第一套引物对为具有SEQ  ID N0.5‑SEQ ID NO.719所示序列或其同源序列；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114369657 A 2所述第二套引物对为具有SEQ  ID N0.720‑SEQ ID NO.1327所示序列或其同源序列。 所述第一套引物对的反应体系按照如下比例配置： 第一引物8 ‑11份， 第一扩增预混合 溶液10‑15份， 基因模板2 ‑5份， 水3‑6份。 所述第二套引物对的反应体系按如下比例配置： 第 二引物1‑5份， 第二扩增预混合溶液 5‑9份， 第一轮引物回收产物3 ‑6份， 水3‑6份。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114369657 A 3