(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210089840.4 (22)申请日 2022.01.25 (71)申请人 中国科学院南海 海洋研究所 地址 511458 广东省广州市南沙区海 滨路 1119号 申请人 南方海洋科学与工程广东省实验室 （广州） (72)发明人 罗鹏　夏淑贤　鄂子譞　尹佳悦　 胡超群　马波　任春华　王艳红　 (74)专利代理 机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 专利代理师 刘明星　朱聪聪 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种海参 通用扩增引物、 扩增方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种海参通用扩增引物、 扩增 方法及应用。 海参通用扩增引物， 引物序列如下： 16S‑NUF:GTCA TCATGACCGTT CTGCAACCGTGCD AAGGT AGCATAAT； 16S ‑NUR:CAGGGTACGGATGTGCGAGCGT CGGTCTGAACTCAGATCATG。 海 参具有非常丰富的种 类， 近年来特别是热带海参的研究、 开发成为热 点。 本发明提供了一种海参通用扩增引物、 扩增 方法及应用， 可以用于海参的分子鉴定、 种系发 生研究以及海域的海参种群的分子监测。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图3页 CN 114703290 A 2022.07.05 CN 114703290 A 1.一种海参 通用扩增引物， 其特 征在于， 靶引物序列如下： 16S‑NUF:GTCATCATGAC CGTTCTGCAACCGTGCDAAGGTAGCATA AT； 16S‑NUR:CAGGGTACGGATGTGCGAGCGTCG GTCTGAACTCAGATCATG。 2.一种鉴别海参的试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1所述的海参 通用扩增引物。 3.一种鉴别 海参的方法， 其特征在于， 提取待测样品的DNA， 然后以权利要求1所述的海 参通用扩增引物进行PCR扩增， 如果扩增片段的大小约为51 1bp， 则是海参， 否则 则不是。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增， 其PCR反应体系为： DNA模 板0.5‑1.5 μL， 5‑15 μM上游引物和5 ‑15 μM下游引物各0.5 ‑1.5 μL， Premix  ExTaq酶2 5 μL， 用灭 菌水补足至 50 μL。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增， 其PCR反应体系为： DNA模 板1.0 μL， 10 μM 上游引物和10 μM 下游引物各 1.0 μL， Premix  ExTaq酶2 5 μL， 用灭菌水补足至50 μL。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增， 其PCR反应程序为： 94℃预 变性2‑5min； 94℃变性15 ‑60sec， 54 ‑58℃退火20 ‑40sec， 72℃延伸30 ‑90sec， 30 ‑35个循环； 72℃延伸4 ‑6min。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述的PCR反应程序为： 94℃预变性4min； 94℃变性3 0sec， 56℃退火3 0sec， 72℃延伸6 0sec， 32个 循环； 72℃延伸5mi n。 8.权利要求1所述的海参 通用扩增引物在鉴别海参中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703290 A 2一种海参通用扩增引物、 扩增方 法及应用 技术领域： [0001]本发明属于海洋生物技术领域， 具体涉及一种海参通用扩增引 物、 扩增方法及应 用。 背景技术： [0002]海参隶属于无脊椎动物(Invertebrate)、 棘皮动物门(Echinodermata)、 海参纲 (Holothuroidea)， 是海产 八珍之一， 海参既具有重要的食用和药用价值， 也具有重要的生 态功能， 是著名的 “海洋清道夫 ”。 目前全球有记录的海参纲物种有约有1700种， 自然分布在 温带或亚热带海域海参种类非常少， 绝大多数的海参种类分布在印度和太平洋的热带海 域。 我国南海 海域有记录的海参种类约有40种， 其中具有食用价 值的多达28种。 [0003]近年来， 随着我国居民消费水平的提高， 海参消费逐年增加， 海参的消费多样化需 求也在增加， 特别是热带海参的消费需求增加明显， 由于加工后海参难以识别导致的乱贴 标牌现象时有发生。 另一方面， 热带海参资源可持续开发利用以及生态增养殖成为当前以 及未来海洋生物领域重要的研究方向。 海参的鉴定是海参研究中重要的一环， 但依靠形态 很难进行区分， 特别是形态相近种， 因此分子鉴定是解决这些问题的最有效方法， 分子鉴定 具有快速、 精准的优点。 [0004]专利CN101659993A公开了一种基于线粒体CO Ⅰ基因片段PCR扩增， 对扩增片段进行 限制酶切， 根据条带 的带形大小及数量对四种海参进行鉴定， 但此方法并不能广泛用于种 类繁多的海参区分。 专利CN108018360B公开了一种DNA微条形码的食用海参物种鉴定方法， 其DNA微条形码 基于对线粒体C OⅠ基因片段的扩增， C OⅠ基因进化速度化， 随着海参测序序列 的增加， 几乎难以发现CO Ⅰ基因保守的区域用于引物设计。 此前我们在专利CN 103923972B中 公开了基于C OⅠ基因片段的扩增以及后续 酶切显示DNA带形的刺参科海参的鉴定方法， 该方 法仅限于刺参科的海参， 不具有通用性。 专利CN103484553A公开了一种基于线粒体16S基因 扩增的快速鉴定10种海参种特异性PCR方法， 但该方法仅对于4个属10种海参 成功进行了扩 增， 并未对遗传跨度巨大、 来源更为广泛的海参进行扩增， 因此其通用性性未知， 此外其扩 增片段只有270bp左右， 基于16S基因的高度保守性， 短片段序列无法提供足够的分辨率对 更为广泛来源的海参进 行区分。 因此， 综合上述， 由于研究积累薄弱以及早期海参线 粒体基 因组序列不完善等原因， 至今没有类似于细菌或藻类的基于保守看家基因的通用分子鉴定 方法用于海参的分子鉴定 。 发明内容 [0005]为了解决上述问题， 本发明提供了一种用于海参的分子鉴定、 种系发生研究以及 海域的海参种群的分子监测的海参 通用扩增引物、 扩增方法及应用。 [0006]本发明的第一个目的是提供一种海参 通用扩增引物， 引物序列如下： [0007]16S‑NUF:GTCATCATGAC CGTTCTGCAACCGTGCDAAGGTAGCATA AT； [0008]16S‑NUR:CAGGGTACGGATGTGCGAGCGTCG GTCTGAACTCAGATCATG。说　明　书 1/6 页 3 CN 114703290 A 3