(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210086609.X (22)申请日 2022.01.25 (71)申请人 武汉市农业科 学院 地址 430070 湖北省武汉市洪山区青菱乡 张家湾特1号 申请人 华中农业大 学 (72)发明人 陈洁　胡长敏　张海艳　郭爱珍　 陈夏冰　邵志勇　万平民　陈颖钰　 许顺鑫　胡秀秀　袁晓丹　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 徐绍新 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种牛无绿藻PCR引物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种根据牛无绿藻cob基因设 计的PCR检测引物， 其核苷酸序列如下： cob ‑5‑F： CTAG TTATTCAAG TCCTCG ； co b ‑5‑R ： AATTACTGTAGCACCCC， 所述牛无绿藻cob基因的核 苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 本发明还公开了 所述的PCR检测引物在牛无绿藻非诊断目的检测 中的应用。 本发明通过对牛无绿藻cob基因的PCR 引物进行筛选， 得到一对灵敏度高且 特异性强的 引物， 将该引物结合荧光定量PCR技术， 能够直接 对牛奶样品中的牛无绿藻进行定性 以及定量测 定， 在早期快速诊断牛无绿藻性乳腺炎方面具有 明显的优势。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图4页 CN 114574611 A 2022.06.03 CN 114574611 A 1.一种根据牛无绿藻(Prototheca  bovis)cob基因设计的PCR引物， 其核苷酸序列如 下： cob‑5‑F： CTAGTTATTCAAGTCCTCG； cob‑5‑R： AATTACTGTAGCAC CCC； 所述牛无绿藻cob基因的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示。 2.权利要求1所述的PCR引物在牛 无绿藻非诊断目的检测中的应用。 3.一种牛 无绿藻检测试剂盒， 其特 征在于： 该 试剂盒含有权利要求1所述的PCR引物。 4.一种非诊断目的 的牛无绿藻实时荧 光定量PCR检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： 1)根据核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示的牛无绿藻cob基因设计PCR引物， 所述PCR引物 的核苷酸序列如下： cob‑5‑F： CTAGTTATTCAAGTCCTCG； cob‑5‑R： AATTACTGTAGCAC CCC； 2)向检测样品中加入所述PCR引物和SYBR荧 光染料， 进行实时荧 光定量PCR反应； 3)根据Ct值大小对牛 无绿藻进行定性或定量检测。 5.如权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR反应的体系如下： SYBR Green Premix Ex Taq  Ⅱ 12.5 μL， cob ‑5‑F 0.8 μL， cob ‑5‑R 0.8 μL， 模板1 μL， RNase ‑ Free Water补足至25 μL。 6.如权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR反应的程序如下： 95℃预变性30s； 95℃变性5s， 59℃退火60s， 72℃延伸30s， 共40个循环； 72℃再次延伸 10min。 7.如权利要求 4所述的检测方法， 其特 征在于， 所述检测样品为牛奶。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574611 A 2一种牛无绿藻PCR引物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子检测领域， 涉及到一种牛无绿藻(Prototheca  bovis)的PCR引物， 本发明还 涉及所述P CR引物在牛无绿藻非诊断目的检测中的应用以及一种牛无绿藻实时荧 光定量PCR检测方法和试剂盒。 背景技术 [0002]牛无绿藻(Prototheca  bovis)是一种类酵母样的真核生物， 曾被称为中型无绿藻 2型(Protothec a zopfii genotype  2)， 能导致奶牛发生乳房炎， 使患牛产奶量下降、 奶品 质降低。 1952年， Lerche报道了第 一例牛无绿藻性乳腺炎(Lerche,et  al.,1952)。 随后， 由 牛无绿藻引起的奶牛乳腺炎在德国、 日本、 意大利、 波兰、 加拿大、 韩国等多个国家相继报 道。 在波兰的16个奶牛场的400头奶牛及其周围环 境的1211份样 本中发现， 牛无绿藻是最常 见的乳腺炎病原体， 且75.8％病例具有亚临床病程(Lloyd  D,et al.,1968)。 2011年， 中国 首次报道了牛无绿藻引起的临床型乳房炎暴发， 分离率高达72.7％(张寒琪等， 2011)。 Shahid等报道了由北京、 天津和山东等地采集的620份牛奶样品和410份环境样 品中， 分别 分离出84份和21份牛无绿藻， 分离率分别为13.5％和5.1 ％(Shahid  M,et al.,2016)。 本课 题组进一步在某牛无绿藻阳性奶牛场调查发现， 在体细胞数高于100万个/mL的40份乳样 中， 牛无绿藻阳性 率高达65％(许顺鑫， 2021)。 [0003]牛无绿藻乳腺炎 的临床诊断极易被误判为真菌或漏诊， 在已报道的病例中， 牛无 绿藻通常是在分娩后立即感染奶牛， 在哺乳开始时发现， 初期临床症状通常不明显， 呈亚临 床或慢性经过(Dubravka  M,et al,2006； Shahid  M,et al.,2017)， 导致奶牛产奶量下降， 奶品质降低， 奶牛分泌含有白色薄片的稀水牛奶， 甚至导致牛乳腺坏死及奶牛过早淘汰， 感 染奶牛成为持续的传染源而使该病在养殖场内不断蔓延。 因临床症状缺 乏特异性， 该病很 容易被忽略或被认为是其他原因造成的乳腺炎， 因而耽误治疗和处理， 严重威胁着奶牛健 康、 生鲜乳质量 安全和奶 业的持续 健康发展。 [0004]现阶段关于牛无绿藻的快速诊断研究较少， 病原的分离鉴定是目前最经典的诊断 方法， 但病原的鉴别培养时间一般超过48小 时， 通常作为其他方法 的比较和参考。 常规PCR 技术一般用于纯培养物的定性检测， 无法直接检测牛奶样品， 而且涉及步骤较多， 存在一定 交叉污染风险， 制约了该项技 术的实际应用。 [0005]例如CN110184379A公开了一种中型无绿藻分子生物 学鉴定方法及 应用， 针对中型 无绿藻基因1型和2型的cob基因分别设计引物， 利用设计的引物及获取的DNA模板进行PCR 反应， 结果表明， 针对中型无绿藻基因2型cob基因设计的引物， 能够从中型无绿藻基因2型 中扩增出目的片段， 而 无法从中型无绿藻基因1型中扩增出目的片段， 该结果表明所设计的 cob引物能正确区分中型无绿藻的两种基因型。 但由于该引物的检测灵敏度低， 无法对奶样 直接进行检测， 需要对牛奶样品进 行病原的分离培养， 得到扩增的菌液后才能进 行检测， 更 无法进行定量检测。 [0006]本发明通过对牛无绿藻cob基因的PCR引物进行大量筛选， 得到一对灵敏度高且特说　明　书 1/9 页 3 CN 114574611 A 3