(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210088957.0 (22)申请日 2022.01.25 (71)申请人 中国农业科 学院兰州兽医研究所 地址 730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡 徐家坪1号 (72)发明人 孙普　张婧　卢曾军　马雪青　 王方洲　李平花　包慧芳　赵志荀　 白兴文　王健　李冬　李坤　 曹轶梅　袁红　刘在新　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 专利代理师 公茂海 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT- PCR检测方法和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒一 步法多重RT ‑PCR检测方法和试剂盒， 建立的一步 法多重RT ‑PCR方法对美洲型PRRSV毒株均可以扩 增出约408bp、 548bp、 689bp特异性条带， 至少扩 增出一条带， 对欧洲型毒株仅扩增出约408bp条 带， 25μL反应体系中3对引物最佳使用量均为 0.5μL(10mmol/μL)， 最佳退火温度为58℃， 循 环数为30～ 35个； 对美洲型毒株的检测能力不低 于25～50TCID50/mL， 具有良好的敏感性； 该方法 对感染猪的常见重要病毒均未扩增出任何片段， 说明特异性良好。 本发明成功建立了PRRSV的一 步法多重RT ‑PCR检测方法， 对美洲型毒株和欧洲 型毒株均具良好的敏感性和特异性， 值得组装成 试剂盒推广应用， 这为猪繁殖与呼吸综合征的快 速准确诊断提供了有效的技 术方法。 权利要求书3页 说明书8页 附图4页 CN 114438260 A 2022.05.06 CN 114438260 A 1.猪繁殖与呼吸综合征病毒一 步法多重RT ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1： 实验材 料的准备； 步骤2： 实验仪器和试剂的选取； 步骤3： 引 物的设计与合成， 比对分析NCBIGenBank数据库 中近年来我国流行的猪繁殖 与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型和欧洲型全基因组序列， 利用Lasergene.V7.1生物学软 件， 设计16对特异性引物， 由北京擎科生物科技有限公司合成， 引物稀释至10m mol/ μL使用； 步骤4： 引物的筛选， 用设计 的16对引物按照常规RT ‑PCR分别扩增PRRSV美洲型的高致 病性毒株GSWW15、 NADC30样毒株GSWW18、 经典毒株VR2332的细胞毒和欧洲型EU细胞毒， 筛选 特异性较好的3对引物； 步骤5： 病毒核酸的提取， 提取PRRSV、 猪瘟病毒(CSFV)、 猪A型塞内卡病毒(SVA)、 O型和A 型口蹄疫病毒(FMDV)的RNA， 提取伪狂犬病毒(PRV)、 圆环病毒2型(PCV2)、 非洲猪瘟病毒 (ASFV)的DNA， 以及疑似PRRSV感染 的临床样本， 经充分研磨后， 4℃离心取上清提取病毒总 RNA； 步骤6： 病毒滴度的测定， 将Marc ‑145细胞接种于96孔板， 10倍倍比稀释PRRSV  GSWW15、 GSWW18和 VR2332毒株细胞培养物上清， 并按每孔100 μL接种于96孔板中长满单层Marc ‑145 细胞上， 每个稀释度重复8孔， 同时设置正常细胞孔作为对照， 每天记录各稀释度出现细胞 病变孔数， 按照Re ed‑Muench方法计算TCID50； 步骤7： 单重RT ‑PCR方法的建立和优化， 以PRRSV美洲型细胞毒GSWW15株、 GSWW18株、 VR2332株和欧洲 型EU株为模板， 建立单重RT ‑PCR反应； 将PCR扩增产物置于2 ％的琼脂糖凝 胶上进行电泳检测， 其次， 在已经优化退火温度的条件下， 分别使用上下游引物各0.2μL、 0.35 μL、 0.5 μL、 0.65 μL、 0.8 μL、 1.0 μL、 1.2 μL， 对3对引物的浓度进行优化， 以确定最佳引物 使用浓度； 步骤8： 多重RT ‑PCR方法的建立和优化， 根据单重RT ‑PCR方法， 建立多重RT ‑PCR方法， 将 PCR扩增产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测， 根据单重RT ‑PCR方法的最佳退火温度 和引物浓度， 在 多重RT‑PCR的退火温度、 引物浓度和反应循环数上进行优化， 在已经优化退 火温度的条件 下， 根据单重RT ‑PCR引物浓度优化结果， 固定引物对F1/R1， F3/R3使用量各为 0.5 μL， 对引物对F2 /R2做浓度梯度， 分别为0.2 μL、 0.35 μL、 0.5 μL、 0.65 μL、 0.8 μL、 1.0 μL、 1.2 μL， 进行多重RT ‑PCR反应， 最后在退火温度和引物浓度优化的基础上， 对反应的循环数进 行 优化， 分别设25、 3 0、 35、 40个循环数， 以确定最佳循环数； 步骤9： 多重RT ‑PCR特异性实验， 按照已经优化的反应条件， 分别以PRRSV美洲型GSWW15 株、 GSWW18株、 VR2 332株和欧洲型EU株的RNA为阳性对照， 以常见重要猪病毒CSFV、 O型FMDV、 A型FMDV、 SVA、 ASFV、 PRV、 PCV 2的核酸为模板， d dH2O为阴性对照， 检验方法的特异性； 步骤10： 多重RT ‑PCR敏感性实验， 将PRRSV  GSWW15株、 GSWW18株、 VR2332株在Marc ‑145 细胞上繁殖病毒， 连续传三代， 使用Marc ‑145细胞测定最后一代各毒株的TCID50。 根据测定 结果， 将毒液进 行10倍梯度稀释， 取等量毒 液提取RNA， 按照已经优化的反应条件， 进行多重 RT‑PCR反应， 以检测该 方法的敏感性； 步骤11： 多重RT ‑PCR重复性实验， 以PRRSV  GSWW15株、 GSWW18株、 VR2332株和EU株为模 板， 用已优化的多重RT ‑PCR方法， 每隔两周检测1次， 连续检测3次， 以评价该方法的可重复 性；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114438260 A 2步骤12： 多重RT ‑PCR临床样品的检测。 利用该方法检测田间临床疑似样品45份， 结果检出15份阳性， 30份阴性， 同时用实时荧 光RT‑PCR方法并行检测， 符合 率达95.6％。 2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 所述步骤1 中实验细胞为Marc ‑145细胞， 用于PRRSV的传代培养； 实验病毒为猪繁殖 与呼吸综合征病毒美洲型GSWW15、 GSWW18、 VR2332毒株和欧洲型EU毒株、 猪瘟病毒(CSFV)、 O 型和A型口蹄疫病毒(FMDV)、 猪A型塞内卡病毒(SVA)、 非洲猪瘟病毒(ASFV)、 猪伪狂犬病毒 (PRV)、 猪圆环病毒2型(PCV2)均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原 生物学国 家重点实验室保存提供； 临床 样品为近 两年采自我国部分省区的养猪场， 共计45份。 3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 所述步骤2中实验仪器和试剂包括HiScriptIIOne  Step RT‑PCR Kit2购自南京诺 唯赞生物科技股份有限公司， One  Step PrimeScriptTMRT‑PCR Kit(Perfect  Real Time)、 DNA Marker、 RNA酶抑制剂购自宝生物工程(北京)有限公司， 病毒基因RNA提取试剂盒购自 Qiagen公司， 病毒基因DNA提取试剂盒购自天跟 生化科技(北京)有限公司， 琼脂糖购自西班 牙BioWeste公司， DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司； PCR仪为杭州博日科技有限公司, 实时荧光PCR仪为ABI  Q5， 电泳仪为北京六一生物科技有限公司， 凝胶成像系统为陕西恩凡 仪器制造有限公司。 4.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 所述 步骤5中按照病毒基因DNA提取 试剂盒操作说明提取ASFV、 PRV、 PCV 2的DNA。 5.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 所述 步骤6中将接种后的Marc ‑145细胞在37℃、 5％CO2细胞培养箱连续培 养5d。 6.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 所述步骤7中单重RT ‑PCR的基础 反应体系为25 μL， 包括2x  One step Mix 12.5 μL， 上下游引物各1μL(10mmol/μL)， RNA模板2μL， One  Step Enzyme Mix 1μL， RNase  Free  ddH2O补足25μL。 单重RT ‑PCR反应程序为： 50℃30min； 94℃3min； 94℃30s， 57℃30s， 72℃ 45s， 30次循环； 72℃5mi n， 4℃保持。 7.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 所述步骤7中以此单重RT ‑PCR方法为基础， 在退火温度和引物浓度上进