(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210091908.2 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 黑龙江省农业科 学院畜牧兽医分院 地址 161000 黑龙江省齐 齐哈尔市龙沙区 合意大街2号 (72)发明人 苗艳　朱庆贺　陈亮　兰世捷　 张蕾　沈思思　李丹　冯万宇　 钟鹏　王洪宝　江波涛　邱景会　 黄宝银　张鹏宇　薛沾枚　张国华　 姚爽　宋国希　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 崔自京(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种鹅星状病毒、 鹅坦布苏病毒检测引物组 和方法 (57)摘要 本发明公开了一种鹅星状病毒、 鹅坦布苏病 毒检测引物组和方法。 属于分子生物学技术领 域。 包括： 引物GoAstV ‑Nano‑F、 引物GoAstV ‑ Nano‑R； 引物TMUV‑Nano‑F、 引物TMUV ‑Nano‑R。 本 发明设计了两对特异性引物， 结合金纳米材料， 建立了一种可同时检测这两种病毒的双重Nano ‑ PCR诊断方法。 结果显示， 对鹅细小病毒、 鹅圆环 病毒、 新城疫病毒和禽腺病毒4种鹅常见病毒的 扩增结果均为阴性。 对GoAstV和TMUV的最低检测 浓度分别为1.21 ×101copies/μL和1.21 × 103copies/μL， 敏感性较双重PCR分别高100倍 和10倍。 具有快速、 特异、 敏感特点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114438261 A 2022.05.06 CN 114438261 A 1.一种鹅星状病毒、 鹅坦布苏病毒检测引 物组， 其特征在于， 包括： 引物GoAstV ‑Nano‑ F、 引物GoAstV ‑Nano‑R； 引物TMUV ‑Nano‑F、 引物TMUV ‑Nano‑R； 所述引物GoAstV ‑Nano‑F的序 列如SEQ ID NO.1所示， 所述引物GoAstV ‑Nano‑R的序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述引物 TMUV‑Nano‑F的序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述引物TMUV ‑Nano‑R的序列如SEQ  ID NO.4所 示。 2.含有权利要求1所述引物组的试剂或试剂盒。 3.一种非诊断治疗目的使用Nano ‑PCR检测鹅星状病毒、 鹅坦布苏病毒 的方法， 其特征 在于， Nan o‑PCR使用权利要求1所述的引物组。 4.如权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取待测样品的总RNA， 反转录为cDNA； (2)建立Nano‑PCR反应体系， 利用引物组进行Nan o‑PCR反应； (3)将PCR反应产物检测， 当样品扩增出458bp和872bp条带时， 说明该样品含鹅星状病 毒、 鹅坦布苏病毒； 当样品只扩增出458b p条带时， 说明该样品含鹅星状病毒； 当样品只扩增 出872bp时， 说明该样品含鹅坦布苏病毒。 5.如权利要求4所述 的方法， 其特征在于： 步骤(2)中Nano ‑PCR反应体系为25μL： 5U/μL   Taq enzyme Mix 0.4 μL， 2×Nano‑qPCR buffer 12.5 μL， GoAstV和TMUV阳性质粒模板各1μ L， 10μM引物GoAstV ‑Nano‑F、 引物GoAstV ‑Nano‑R、 引物TMUV ‑Nano‑F、 引物TMUV ‑Nano‑R各 0.5 μL， ddH2O8.1 μL。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于： 步骤(2)中Nano ‑PCR反应条件为： 94℃预变性 3min； 94℃变性3 0s， 50℃退火3 0s， 72℃延伸1mi n， 循环35次； 72℃延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438261 A 2一种鹅星状病毒 、 鹅坦布苏病毒检测引物组和方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 更具体 的说是涉及一种鹅星状病毒、 鹅坦布苏 病毒检测引物组和方法。 背景技术 [0002]雏鹅痛风是由鹅星状病毒引起的一种以内脏器官和关节尿酸盐沉积为主要特征 的鹅新型传染病， 给我国鹅养殖业造成严重经济损失。 鹅坦布苏病 是由黄病毒引起的一种 以产蛋下降、 脑炎样神经症状和传染性卵巢炎为主要症状的鹅传染病， 该病严重危害养鹅 业的发展。 [0003]目前已报道的用于检测GoAstV和TMUV的方法主要包括病毒分离培养、  RT‑PCR、 RT‑qPCR、 环介导等温扩增(LAMP)和下一代测序等。 临床中较为常用的是常规PCR， 传统的 PCR检测方法灵敏度较低， 实时荧光定量PCR检测需要 昂贵的仪器， LAMP检测则较容易被污 染。 [0004]因此， 如何提供一种鹅星状病毒、 鹅坦布苏病毒检测引 物组和方法是本领域技术 人员亟需解决的问题。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了一种鹅星状病毒、 鹅坦布苏病毒检测引物组和方法。 [0006]本发明建立了一种特异性好， 灵敏度高的双重Nano ‑PCR检测方法， 用于临床样品 中GoAstV和TMUV的快速检测， 为今后相关疾病的检测 和试剂盒的研制奠定基础 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0008]一种鹅星状病毒、 鹅坦布苏病毒检测引物组， 包括： 引物GoAstV ‑Nano‑F、 引物 GoAstV‑Nano‑R； 引物TMUV ‑Nano‑F、 引物TMUV ‑Nano‑R； 引物 GoAstV‑Nano‑F的序列如SEQ   ID NO.1所示， 引物GoAstV ‑Nano‑R的序列如  SEQ ID NO.2所示， 引物TMUV ‑Nano‑F的序列如 SEQ ID NO.3所示， 引物  TMUV‑Nano‑R的序列如SEQ  ID NO.4所示。 [0009]本发明还提供了含有上述引物组的试剂或试剂盒。 [0010]本发明还提供了一种非诊断治疗目的使用Nano ‑PCR检测鹅星状病毒、 鹅坦布 苏病 毒的方法， Nan o‑PCR使用上述的引物组。 [0011]优选的： 包括以下步骤： [0012](1)提取待测样品的总RNA， 反转录为cDNA； [0013](2)建立Nano‑PCR反应体系， 利用引物组进行Nan o‑PCR反应； [0014](3)将PCR反应产物检测， 当样品扩增出458bp和872bp条带时， 说明该样品含鹅星 状病毒、 鹅坦布苏病毒； 当样品只扩增出458b p条带时， 说明该样品含 鹅星状病毒； 当样品只 扩增出872bp时， 说明该样品含鹅坦布苏病毒。 [0015]优选的： 步骤(2)中Nano ‑PCR反应体系为25 μL： 5U/ μL  Taq enzyme Mix 0.4 μL， 2× Nano‑qPCRbuffer  12.5 μL， GoAstV和TMUV阳性质粒模板各 1 μL， 10 μM引物GoAstV ‑Nano‑F、 引说　明　书 1/5 页 3 CN 114438261 A 3