(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210093716.5 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 重庆巴斯德生物医药 科技有限公司 地址 400700 重庆市北碚区京东方大道3 04 号 (72)发明人 张祥林　张劲松　侯艳雯　魏鹏　 陈晨　胡秋萍　 (74)专利代理 机构 上海光华专利事务所(普通 合伙) 31219 代理人 王秋霞　许亦琳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/72(2006.01)C12R 1/725(2006.01) C12R 1/68(2006.01) C12R 1/67(2006.01) C12R 1/685(2006.01) C12R 1/85(2006.01) (54)发明名称 一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组 及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 特别是涉及一种 联合检测多种肺部感染真菌的引物组及试剂盒， 所述PCR引物组包括白色念珠菌检测引物对、 热 带念珠菌检测引物对、 光滑念珠菌检测引物对、 烟曲霉检测引物对、 黄曲霉检测引物对、 黑曲霉 检测引物对、 新型隐球菌检测引物对。 所述试剂 盒中包括多重PCR反应物， 所述多重PCR反应物中 包括所述PCR引物组。 本发明的引物组和试剂盒 利用多重PCR与毛细管片段分析法相结合， 可以 联合检测七种肺部感染真菌， 该方法操作简单、 检测准确、 通量高、 灵敏高、 特异性高， 显著缩短 检测时间， 可以实现2 ‑3小时内可 出检测结果。 权利要求书1页 说明书16页 序列表9页 附图5页 CN 114350846 A 2022.04.15 CN 114350846 A 1.一种联合检测多种肺部感染真菌的PCR引物组， 其特征在于， 所述PCR引物组包括白 色念珠菌检测引物对、 热带念珠菌检测引物对、 光滑念珠菌检测引物对、 烟曲霉检测引物 对、 黄曲霉 检测引物对、 黑曲霉 检测引物对、 新型隐球菌检测引物对。 2.根据权利要求1所述的PCR引物组， 其特 征在于， 所述PCR引物组还 包括以下 特征： 1)白色念珠菌检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的上游引 物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.2所示的下游引物； 2)热带念珠菌检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引 物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.4所示的下游引物； 3)光滑念珠菌检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的上游引 物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.6所示的下游引物； 4)烟曲霉检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示的上游引 物和核苷酸序列 如SEQ ID NO.8所示的下游引物； 5)黄曲霉检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示的上游引 物和核苷酸序列 如SEQ ID NO.10所示的下游引物； 6)黑曲霉检测引物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列 如SEQ ID NO.12所示的下游引物； 7)新型隐球菌检测引物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示的上游引物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.14所示的下游引物。 3.权利要求1或2所述的PCR引物组在制备检测白色念珠菌、 热带念珠菌、 光滑念珠菌、 烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒中的用途。 4.一种联合检测白色念珠菌、 热带念珠菌、 光滑念珠菌、 烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和新型 隐球菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 中包括多重PCR反应物， 所述多重P CR反应物中包 括权利要求1或2所述的PCR引物组。 5.根据权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述多重PCR反应物中还包括Multiplex   PCRMix和/或内参扩增引物对。 6.根据权利要求5所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述内参扩增引物对包括核苷酸序列如 SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示的下游引物。 7.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 以所述多重PCR反应物的总体积为基准， 每条引物的浓度为10 0nmol/L～300nmol/L。 8.根据权利要求4所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒中还包括样品基因组提取试 剂、 阳性质控品、 阴性质控品中的任一项或多 项。 9.根据权利要求8所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述阳性质控 品为含各目标真菌特异核 酸片段和人DNA内参特异核酸片段的pUC 57质粒DNA， 和/或， 所述阴性质控品为TE缓冲液。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性质控品的核苷酸序列如SEQ   ID NO.17～SEQ  ID NO.23所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350846 A 2一种联合检测多种肺部感 染真菌的引物组及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 特别是涉及一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组 及试剂盒。 背景技术 [0002]真菌在自然环境中广泛分布， 也是人类皮肤、 粘膜表面定植的常见菌， 通过躲避人 类免疫系统而与人类共生。 然而， 在免疫系统受损或宿 主屏障破坏的情况下， 真菌能够侵入 人体， 导致致死性感染。 侵袭性肺部真菌感染(Invasive  Pulmonary  Fungal Infection， IPFI)是不包括真菌寄生和过敏性所致的支气管肺部真菌感染， 分为原发性和继发性两种 类型。 近年来， 随着人口老龄化﹑ 器官移植免疫抑制剂的使用、 肿瘤放化疗、 造血干细胞移 植、 超广谱抗生素和多种抗生素联合应用、 皮质类固醇激素 的使用以及各种导管介入治疗 等， 使侵袭性肺部真菌感染的发病率呈现逐渐上升的趋势。 引起侵袭性肺部真菌感染常见 的真菌主要是念珠菌属、 曲霉属、 隐球菌属、 接合菌属(主要是毛霉)和肺孢子菌等。 由于肺 部真菌感染临床表现常无特异性， 早期诊断困难， 且病情易被基础病掩盖， 造成误诊、 漏诊 而延误治疗。 正确、 及时诊断肺部真菌感染依赖 于实验室精准的检测结果。 [0003]肺部真菌感染的常见实验室检测方法包括： 直接显微镜检查、 组织病理学检查、 真 菌培养、 血清学检测(1,3 ‑β‑D葡聚糖检测、 半乳甘露聚糖检测、 隐球菌荚膜多糖抗原检测、 曲霉菌抗体等)、 影像学检查和基于核酸检测的分子生物学方法等。 目前， 组织病理检查依 然是诊断真菌感染的 “金标准”。 但由于其为有创性操作， 患者难以忍受。 其结果受限于取材 的准确性， 阳性率低。 诊断结果经过一系 列实验过程， 耗时较长， 不利于早期诊断。 直接显微 镜检查是最经典的方法， 具有快速、 简便的特点， 但是阳性率较低。 传统的真菌培养方法需 要至少3‑5天， 甚至需要更长的时间， 且敏感性较低， 不利于早期诊断。 抗原检测特异度较 好， 但灵敏度较低， 常有假阴性。 抗体检测对于侵袭性肺部真菌感染早期诊断意义有限。 以 荧光定量PCR技术为代表的分子生物学方法， 已逐步成为侵袭性肺部真菌感染诊断的重要 方法。 尽管荧光定量P CR具有高特异性、 敏感性和时效性， 但 也存在如下缺点： (1)通量低： 受 限于荧光通道， 单管仅能检测3种真菌； (2)成本高： 多种真菌同时检测， 成本较高。 发明内容 [0004]鉴于以上所述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提供一种联合检测多种肺部感 染真菌的引物组及试剂盒， 用于解决现有技 术中的问题。 [0005]为实现上述目的及 其他相关目的， 本发明提供一种联合检测多种肺部感染真菌的 PCR引物组， 所述PCR引物组包括白色念珠菌检测引物对、 热带念珠菌检测引物对、 光滑念珠 菌检测引物对、 烟曲霉检测引物对、 黄曲霉检测引物对、 黑曲霉检测引物对、 新型隐球菌检 测引物对。 [0006]优选的， 所述PCR引物组还 包括以下 特征： [0007]1)白色念珠菌检测引物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的上游引物和核说　明　书 1/16 页 3 CN 114350846 A 3