(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210094200.2 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 深圳市儿童医院 地址 518017 广东省深圳市福田区莲 花街 道益田路7019号 申请人 深圳大学 (72)发明人 谢中建　李德发　陈挚　郑斐　 张晗　 (74)专利代理 机构 深圳市华盈知识产权代理事 务所(普通 合伙) 44543 专利代理师 王松柏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01)B01J 13/02(2006.01) (54)发明名称 一种PLGA微球-CRISPR 免疫共沉淀法检测杜 氏肌萎缩症的试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种PL GA微球‑CRISPR免疫共 沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 属于分子生 物学和医药领域。 所述试剂盒具体包括： PLGA微 球， PLGA微球表面羧基活化剂， dCas9蛋白， 杜氏 肌萎缩症检测用sgRNA。 所述杜氏肌萎缩症检测 用sgRNA， 为SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.10中的任 意一条。 本发明是利用CRISPR技术将dCas9蛋白 ‑ sgRNA‑捕获的杜氏肌萎缩症相关的特定基因片 段结合， 用PLGA微球免疫共沉淀法抓取dCas9蛋 白与基因片段的复合体， 并分别分析dCas9蛋白 和基因片段含量。 这是一种快速进行早期筛查杜 氏肌萎缩症患者的方法。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图2页 CN 114540461 A 2022.05.27 CN 114540461 A 1.一种PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 具体 包括： PLGA微球， PLGA微球表面 羧基活化剂， dCas9蛋白， 杜氏肌 萎缩症检测用sgRNA。 2.根据权利要求1所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 所述PLGA 微球通过乳液法制备而 得， 使用聚乙烯醇作为表 面活性剂和稳定剂， 在超声辅助下 得到稳定 乳液。 3.根据权利要求1所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 所述的PLGA 微球表面羧基活化剂， 包括1 ‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二 亚胺和N‑羟基硫代琥珀酰 亚胺。 4.根据权利要求1所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA是以杜氏肌萎缩症的致病基因序列互补单链 DNA为模版， 通过体外转录反应制备而得。 5.根据权利要求4所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 所述的杜氏肌萎缩症的致病基因序列， 为DMD基因的第3外显子的部分序列或 第51外显子的部分序列； 所述第3外显子的部分序列为SEQ  ID NO.1； 所述第51外 显子的部分序列为SEQ  ID NO.2。 6.根据权利要求4所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 所述的杜氏肌萎缩症的致病基因序列， 为第3外显子和第51外显子上的4段序 列SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6中的任意 一条。 7.根据权利要求1所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 所述杜氏肌萎缩症检测用sgRNA， 为SEQ  ID NO.7至SEQ  ID NO.10中的任意一 条。 8.根据权利要求1所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 所述PLGA微球的制备 方法， 具体步骤如下： 1)配制PLGA有机相溶液： 将50mg的PLGA粉末加入5mL二 氯甲烷中， 冰水浴搅拌至完全溶 解； 2)配制稳定剂/表面活性剂水相溶液： 将0.2g聚乙烯醇粉末加入20mL去离子水中， 95℃ 下搅拌1小时至 完全溶解； 3)获得白色稳定乳液： 将步骤1)的PLGA有机相 溶液和步骤2)的稳定剂/表面活性剂水 相溶液混合， 使用功 率100W的探头超声仪， 在冰水浴中， 对混合液体进行超声处理2分钟， 随 即可得到白色稳定 乳液； 4)获得PLGA微球分散液： 将步骤3)获得的白色稳定乳液在通风橱中， 常温搅拌4 ‑5小 时， 使乳液中低沸点的有机溶剂二氯甲烷自然挥发， 从而得到硬化的PLGA微球分散液； 5)清洗PLGA微球： 将步骤4)PLGA微球分散液转移至微量离心管中， 转速800rpm离心10 分钟， 去除上清， 再加入等体积的去离 子水， 在水浴超声辅助下重新分散PLGA微球； 6)重复步骤5)的离心 ‑再分散清洗过程重复3 ‑5遍以完全去除分散液中残余的PV A； 7)清洗完成后将PLGA微球以1％的浓度分散在去离 子水中， 获得PLGA微球。 9.根据权利要求8所述的PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀法检测杜氏肌萎缩症的试剂盒， 其特征在于： 步骤2)中所述的聚乙烯醇为平均分子量20 000‑200000之间的聚乙烯醇。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540461 A 2一种PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀 法检测杜氏肌萎缩症的试 剂盒 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学和医药领域， 尤其涉及一种PLGA微球 ‑CRISPR免疫共沉淀 法检测杜氏肌 萎缩症的试剂盒。 背景技术 [0002]近年来， 随着各种靶标特异性核酸检测工具的开发和全基因组测序技术的发展， 各种病理学的生物标志物的分析和鉴定方法得到了迅速发展。 在过去的30年中， 基于聚合 酶链式反应(PCR)的核酸诊断测试方法已经得到极大的发展， 甚至已经成为病毒核酸检测 的金标准。 尽管如此， PCR核酸检测方法因为需要多步反应， 多种试剂以及要求训练有素的 操作人员和复杂的仪器， 在临床 应用时仍然耗时且昂贵。 因此， 新的核酸分子检测方法需要 克服常规核酸检测策略的局限性， 以提供低 成本、 高集成度、 紧凑便捷的核酸诊断工具， 从 而扩展其临床应用。 [0003]在分子生物学领域， 基于常间回文重复序列丛集(CRISPR)及相关的核酸酶(Cas) 的基因编辑技术无疑是 受到最广泛关注。 CRISPR ‑Cas分子系统可以通过非同源末端 连接或 同源性定向修复来纠正基因突变， 从而提供了基因治疗的新策略而 备受关注。 此外， 这种强 大的基因靶向编辑技术不仅仅在治疗方面， 同时也可被用作核酸突变位点靶向检测的新方 法。 CRISPR ‑Cas蛋白可以在单链引导RNA(sgRNA)的引导下， 成为序列特异性靶向和检测的 强大工具。 核酸酶失活的Cas9(dCas9)是Cas9的一种无酶活性的突变体， 其中其核酸内切酶 活性无效。 其制备方法是化脓性链球菌Cas9蛋白的HNH域中引入H840A突变， 并在RuvC域中 引入了D10A突变， 即可产生核酸酶缺陷型dCas9， 也称为dCas9 空突变体(null  mutant)。 尽 管Cas9的这个 “失活”版本不再能够切割DNA， 但在sgRNA的引导下， 它仍然能够以相同的精 度靶向结合目标序列的DNA分子。 近年来， CRISPR/dCas9的应用得到了扩展和 多样化。 在本 发明中， 不具备内切活性的CRISPR ‑dCas9蛋白与sgRNA的形成分子复合物， 可以通过扫描整 个基因组样本， 逐步解开DNA双螺旋结构， 寻找并结合目标突变位点， 从而实现靶向检测 基 因组治病突变位 点的功能。 [0004]免疫沉淀法一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白或相关抗体， 对蛋白进 行亲和纯化。 这种方法可以采用固定在特殊材料的微珠支持物上的特定抗体从复杂的混合 物中纯化单一蛋白。 免疫共沉淀法与免疫沉淀法的原理十分相似， 但免疫共沉淀法的目标 更倾向于分离抗原及与抗原结合的蛋白质。 常用的微珠支持物为琼脂糖树脂， 常用的固定 亲和有蛋白A、 蛋白G、 蛋白A/G等。 但是， 这种微球在实际应用中尝尝会在体系中引入自身 亲 和蛋白的干扰， 对下游酶联免疫吸附试验(ELISA)、 Western 印迹法(Western  blot)等后 续 蛋白检测造成背景干扰。 [0005]PLGA(乳酸 ‑乙醇酸共聚物)是通过两种不同的单体(乙醇酸和乳酸 的环状二聚体 (1,4‑二恶烷‑2,5‑二酮))的开环共聚而合成的。 由于其具有生物降解性和生物相容性， 因 此已在美国食品药品管理局(FDA)批准的治疗方案中被广泛使用。说　明　书 1/8 页 3 CN 114540461 A 3