(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210093411.4 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 上海宝藤生物医药 科技股份有限公 司 地址 201203 上海市浦东 新区中国 （上海） 自由贸易试验区张衡路180弄3号楼5 层 申请人 上海宝藤医学检验所有限公司 　 上海张江医学创新研究院 (72)发明人 王博伟　汪梦竹　吴煜　周凯月　 何顺清　林灵　 (74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 赵颖(51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测叶酸代谢相关基因多态性的引物 探针组合及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种检测叶酸代谢相关基因 多态性的引物探针组合及其应用， 所述检测叶酸 代谢相关基因多态性的引物探针组合特异性扩 增并检测MTHFR基因C677T、 MTHFR基因A1298C和 MTRR基因A66G的多态性情况； 扩增所述MTHFR基 因C677T的特异性引物对的上游引物包括SEQ  ID  No.1所示的核苷酸序列， 下游引物包括SEQ  ID  No.2所示的核苷酸序列， 检测所述MTHFR基因 C677T的探针包括SEQ  ID No.3所示的核苷酸序 列。 本发明还提供了一种检测叶酸代谢相关基因 多态性的试剂盒。 本发明所述引物探针组合灵敏 度高， 特异性好， 检测效率高， 容易操作， 应用前 景广阔。 权利要求书2页 说明书20页 序列表3页 附图3页 CN 114350791 A 2022.04.15 CN 114350791 A 1.一种检测叶酸代谢相关基因多态性的引物探针组合， 其特征在于， 所述检测叶酸代 谢相关基因多态性的引物探针组合特异性扩增并检测MTHFR基因C677T、 MTHFR基因A1298C 和MTRR基因A66G的多态性情况； 扩增所述MTHFR基因C677T的特异性引物对的上游引物包括SEQ  ID No.1所示的核苷酸 序列， 下游引物包括SEQ  ID No.2所示的核苷酸序列， 检测所述MTHFR基因C677T的探针包括 SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的引物探针组合， 其特征在于， 扩增所述MTHFR基因A1298C的特异性引物对的上游引物包括SEQ  ID No.4所示的核苷酸序 列， 下游引物包括SEQ  ID No.5所示的核苷酸序列， 检测所述MTHFR基因A1298C的探针包括 SEQ ID No.6所示的核苷酸序列； 优选地， 扩增 所述MTRR基因A66G的特异性引物对的上游引物包括SEQ  ID No.7所示的 核苷酸序列， 下游引物包括SEQ  ID No.8所示的核苷酸序列， 检测所述MTRR基因A66G的探针 包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。 3.根据权利要求1或2所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的引物探针组合， 其特征在 于， 所述探针的5 ’端修饰荧 光基团， 3 ’端修饰淬灭基团； 优选地， 所述 荧光基团包括FAM、 VIC或C Y5中的任意 一种； 优选地， 所述淬灭基团包括BHQ1或BHQ2； 优选地， 检测所述MTHFR基因C 677T的探针的荧 光基团为FAM， 淬灭基团为BHQ1； 优选地， 检测所述MTHFR基因A12 98C的探针的荧 光基团为VIC， 淬灭基团为BHQ1； 优选地， 检测所述MTR R基因A66G的探针的荧 光基团为C Y5， 淬灭基团为BHQ2。 4.一种检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒， 其特征在于， 所述检测叶酸代谢相关 基因多态性的试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的引 物探针组合； 优选地， 所述特异性引物对的终浓度为0.006～0.3μmol/L， 所述探针的终浓度为0.01 ～0.06 μmol/L； 优选地， 扩增 所述MTHFR基因C677T的特异性引物对的上游引物的终浓度为0.01μmol/ L， 下游引物的终浓度为0.2 μmol/L， 检测所述MTHFR基因C677T的探针的终浓度为0.05 μmol/ L； 优选地， 扩增所述MTHFR基因A1298C的特异性引物对的上游引物的终浓度为0.06 μmol/ L， 下游引物的终浓度为0.006 μmol/L， 检测所述MTHFR基因A1298C的探针的终浓度为0.01μ mol/L； 优选地， 扩增所述MTRR基因A66G的特异性引物对的上游引物的终浓度 为0.3 μmol/L， 下 游引物的终浓度为0.0 3 μmol/L， 检测所述MTR R基因A66G的探针的终浓度为0.0 6 μmol/L。 5.根据权利要求4所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂 盒， 其特征在于， 所述检 测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒还 包括dNTPs、 Taq  DNA聚合酶、 Mg2+和PCR反应缓冲液； 优选地， 所述dNTPs的终浓度为0.1～0.5m mol/L， 优选为0.2m mol/L； 优选地， 所述Taq  DNA聚合酶的终浓度为0.01～0.0 5U/ μL， 优选为0.025U/ μL； 优选地， 所述Mg2+的终浓度为1～5m mol/L， 优选为2m mol/L； 优选地， 所述PCR反应缓冲液包括Tris ‑HCl和KCl；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114350791 A 2优选地， 所述Tris ‑HCl的终浓度为2 ～7mmol/L， 优选为5m mol/L； 优选地， 所述KCl的终浓度为8～12m mol/L， 优选为10m mol/L。 6.一种权利要求4或5所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂 盒的使用方法， 其特 征在于， 所述使用方法包括： 使用所述检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂 盒对待测样本进行扩增及检测， 再进行 分析。 7.根据权利要求6所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒的使用方法， 其特征 在于， 所述扩增及检测的程序包括： 预变性： 94～ 97℃， 2～5min； 循环延伸： 94～ 97℃， 5～15s； 5 6～60℃， 25～3 5s； 循环3 5～40次； 退火延伸： 94～ 97℃， 1～3mi n； 38～42℃， 0.5～ 2min； 收集信号： 40～85℃， 其中升温速率 为0.01～0.0 6℃/s， 优选为0.0 6℃/s。 8.根据权利要求6或7所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂 盒的使用方法， 其特 征在于， 所述分析的依据包括： 对于MTHFR基因C 677T位点， Tm值为72±1.5℃， 判定为T； Tm值 为66±1.5℃， 判定为C； 对于MTHFR基因A12 98C位点， Tm值为70±1.5℃， 判定为C； Tm值 为64±1.5℃， 判定为A； 对于MTRR基因A66G位点， Tm值为72±1.5℃， 判定为G； Tm值 为66±1.5℃， 判定为A。 9.根据权利要求6～8任一项所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒的使用方 法， 其特征在于， 所述使用方法包括： (1)使用所述检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒对待测样本进行扩增及检测， 所 述扩增及检测的程序包括： 预变性： 94～ 97℃， 2～5min； 循环延伸： 94～ 97℃， 5～15s； 58～62℃， 25～3 5s； 循环3 5～40次； 退火延伸： 94～ 97℃， 1～3mi n； 38～42℃， 0.5～ 2min； 收集信号： 40～85℃， 其中升温速率 为0.01～0.0 6℃/s； (2)分析： 对于MTHFR基因C 677T位点， Tm值为72±1.5℃， 判定为T； Tm值 为66±1.5℃， 判定为C； 对于MTHFR基因A12 98C位点， Tm值为70±1.5℃， 判定为C； Tm值 为64±1.5℃， 判定为A； 对于MTRR基因A66G位点， Tm值为72±1.5℃， 判定为G； Tm值 为66±1.5℃， 判定为A。 10.权利要求1～3任一项所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的引物探针组合、 权利 要求4或5所述的检测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒或权利要求6～9任一项所述的检 测叶酸代谢相关基因多态性的试剂盒的使用方法中的任意一种或至少两种的组合在叶酸 代谢相关基因多态性检测中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114350791 A 3