(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210105137.8 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 河南农业大 学 地址 450002 河南省郑州市金 水区文化路 95号 (72)发明人 杨路明　刘东明　朱华玉　杨森　 豆峻岭　孙东玲　 (74)专利代理 机构 北京华际知识产权代理有限 公司 11676 代理人 袁瑞红 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁的分子 标记及其应用 (57)摘要 本发明公开了两对与西瓜绿花基因Clgf紧 密连锁的分子标记及应用， 属于生物技术领域。 本发明利用亲本和F2群体进行表型鉴定， 根据 BSA原理， 利用SSR标记对绿花性状相关基因进行 初步定位。 结合亲本的重测序开发SSR、 Indel标 记， 在父母本进行多态性筛选， 用具有多态性的 引物在F2群体中进行基因型鉴定， 将西瓜绿花基 因Clgf定位在标记ClSSR30082和Indel186之间。 本发明的分子标记可为鉴定西瓜花色提供新手 段， 加速西瓜育种的改良进程， 提高育种的准确 性和选择效率。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 114292954 A 2022.04.08 CN 114292954 A 1.与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁的SSR分子标记， 其特征在于， 扩增所述分子标记 的引物对的上游引物序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游引物序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁的Indel分子标记， 其特征在于， 扩增所述分子标 记的引物对的上游引物序列如SEQ  ID NO.5所示， 下游引物序列如SEQ  ID NO.6所示。 3.权利要求1或权利要求2所述的与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁 的分子标记在西 瓜分子育种中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述分子标记用于鉴定或辅助鉴定西瓜花 瓣颜色性状。 5.一种西瓜绿色花 瓣品种的判定方法， 其特 征在于， 所述判定方法包括如下步骤： (1)提取待测西瓜 基因组DNA； (2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板， 利用权利 要求1所述分子标记的引物对进行 PCR扩增， 对PCR扩增产物进行电泳检测 和/或测序； (3)根据步骤(2)的电泳条 带和/或测序结果进行判定， 具体标准 为： 如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ  ID NO.4所示 的长度为248bp的特征条带， 则该待测 品种为西瓜 绿色花瓣性状的品种； 如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ  ID NO.3所示的长度为 268bp的特征条带， 则待测品种为纯合西瓜黄色花瓣性状品种； 如果PCR扩增产物中既有一 条如SEQ ID NO.3所示的长度为248bp的特征条带， 又有一条如SEQ  ID NO.4所示的长度为 268bp的特 征条带， 则该待测品种为杂合西瓜黄色花 瓣性状品种。 6.一种西瓜绿色花 瓣品种的判定方法， 其特 征在于， 所述判定方法包括如下步骤： (1)提取待测西瓜 基因组DNA； (2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板， 利用权利 要求2所述分子标记的引物对进行 PCR扩增， 对PCR扩增产物进行电泳检测 和/或测序； (3)根据步骤(2)的电泳条 带和/或测序结果进行判定， 具体标准 为： 如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ  ID NO.7所示的长度为82bp的特征条带， 则该待测品 种为西瓜黄色花瓣性状的品种； 如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ  ID NO.8所示的长度为 76bp的特征条带， 则待测品种为纯合西瓜绿色花瓣性状品种； 如果PCR扩增产 物中既有一条 如SEQ ID NO.7所示的长度为82bp的特征条带， 又有 一条如SEQ  ID NO.8所示的长度为76bp 的特征条带， 则该待测品种为杂合西瓜黄色花 瓣性状品种。 7.一种用于鉴定西瓜绿色花瓣性状的试剂 盒， 其特征在于， 包含权利要求1或权利要求 2中所述的引物对。 8.用于检测SSR分子标记是否存在的试剂在西瓜花瓣颜色基因定位中的应用， 其特征 在于， 扩增所述标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.1所示， 下游引物序列如 SEQ.ID.NO.2所示。 9.用于检测Indel标记是否存在的试剂在西瓜花瓣颜色基因定位中的应用， 其特征在 于， 扩增所述标记的引物对的上游引物序列如SEQ.ID.NO.5所示， 下游引物序列如 SEQ.ID.NO.6所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114292954 A 2与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁的分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 具体涉及与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁的分子 标记及其应用。 背景技术 [0002]花色是植物遗传的重要性状， 主要吸引昆虫授粉。 花色可以影响蚜虫取食， 生产中 选育不同花色的作物品种 具有降低蚜虫传病的作用， 也可以维持花瓣的能量平衡， 避免花 器官受伤害。 花色是观赏植物重要的外观性状， 多样的花色不仅可以用于装饰和美化生活 和工作环境， 还可以丰富人们的精神生活。 [0003]在十字花科作物中， 付东辉等培育出38种颜色的油菜花色。 Yang等， 构建了一个来 源于Y640 ‑288(白花)和 Y641‑87(黄花)品系的F2群体， 将大白菜白花基因BrWF3定位在2号 染色体105.6kb的区间， 在第三个外显子的一个SNP缺失导致了蛋白质功能的丧失， 干扰了 PGs的形成， 进而降低了类胡萝卜素代谢的活性和类胡萝卜素的含量。 Jia等利用油菜黄花 栽培种‘Zhongshuang  11’和白花自交系 ‘White Petal’通过转录组学和代谢组学分析了参 与类胡萝卜素生物合成基因表达， 发现BnNCED4b编码一种 参与类胡萝卜素降解的蛋白质， 在白色花瓣中有异常高的水平表达， 这表明它 可能在白色花瓣的形成中起着关键作用。 在 茄科植物中， Wang等发现茄子紫花性状由单显性基因控制， 并将这个编码花青素合酶的基 因SmFAS定位在8号染色体上约165.6kb的区域内， 一个单碱基的突变导致FAS的过早终止， 导致花瓣呈白色。 [0004]在葫芦科作物中对花色的研究较少， 西瓜花瓣通常是黄色的， 但是Young ‑Seok  Kwo等在西瓜品系Kw ‑695中， 发现了淡 绿色的花。 通过研究发现Kw ‑695浅绿色花性状的遗传 受一个隐性基因Clgf控制。 Kw ‑695植物有大的藤蔓和大的浅 绿色叶子， 椭圆形的、 黄 绿色并 带有不规则深绿色条纹的果 实， 黄色到橙色， 不可食用的果肉， 含糖量 非常低， 浅黄 色种子。 Young‑Seok Kwo等对其遗传规律进行了分析， 并没有进行分子水平的研 究。 通过前人研 究 我们发现， 目前还没有定位到控制西瓜花 瓣颜色的基因。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供了两对与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁的分子标记， 分 别为SSR分子标记和Indel分子标记， 分别采用两种标记形式对西瓜 绿色花瓣基因Clgf进行 定位， 为西瓜花色 分子标记辅助育种提供帮助。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供以下技 术方案： [0007]本发明通过分离群体分组分析法(BSA)， 获得了位于第11号染色体上的具有多态 性差异的12对SSR引物， 通过分析， 其中一个SSR分子标记与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连 锁， 扩增所述分子标记的引物对的上游引物序列如SEQ  ID NO.1所示， 下游引物序列如SEQ   ID NO.2所示。 [0008]本发明还采用另外一种标记形式找到了与西瓜绿色花瓣基因Clgf紧密连锁的说　明　书 1/7 页 3 CN 114292954 A 3