(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210093469.9 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 黑龙江省农业科 学院畜牧兽医分院 地址 161000 黑龙江省齐 齐哈尔市龙沙区 合意大街2号 (72)发明人 苗艳　朱庆贺　陈亮　兰世捷　 张蕾　沈思思　李丹　冯万宇　 钟鹏　金振华　张红　田秋丰　 刘秋瑾　张备　武晓东　姚橹　 李白　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 崔自京(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测GPV、 GoAstV和GPMV的Nano- PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种同时检测GPV、 GoAstV和 GPMV的Nano ‑PCR检测方法， 属于分子生物学技术 领域。 本发明公开的一种同时检测GPV、 GoAstV和 GPMV的Nano ‑PCR检测方法， 根据GPV、 GoAstV和 GPMV的保守基因序列设计了 特异性引物， 建立了 一种能够同时检测三种病毒的特异性强、 敏感性 高的Nano ‑PCR检测方法； 对GPV、 GoAstV和GPMV检 测的敏感性是普通PCR的10到100倍， 且对AIV、 FAdV和TMUV均无扩增， 具有较好的特异性， 可用 于GPV、 GoAst V和GPMV的临床检测。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114540545 A 2022.05.27 CN 114540545 A 1.一种同时检测GPV、 GoAst V和GPMV的Nan o‑PCR检测方法， 其特 征在于， 具体步骤如下： (1)样品预处 理， 获得cDNA； (2)以步骤(1)获得的cDNA为模板， 利用引物GPV ‑Nano‑F/R、 GoAstV ‑Nano‑F/R、 GPMV ‑ Nano‑F/R进行Nan o‑PCR检测； 所述Nano ‑PCR检测的反应体系为： 5U/μL  Taq enzyme Mix 0.4μL， 2 ×Nano‑ qPCRbuffer  12.5 μL， 模板3 μL， 三种病毒的上下游引物各1.25 μL， ddH2O 1.6 μL， 共25 μL； 所 述三种病毒的上下游引物终浓度均为0.5 μM； 反应条件为： 94℃预变性3min； 94℃变性30s， 50℃退火3 0s， 72℃延伸1mi n， 循环35次； 72℃延伸10mi n； (3)对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。 2.根据权利要求1所述 的一种同时检测GPV、 GoAstV和GPMV的Nano ‑PCR检测方法， 其特 征在于， 步骤(2)所述引物GPV ‑Nano‑F/R、 GoAstV ‑Nano‑F/R、 GPMV ‑Nano‑F/R的具体序列如 下： GPV‑Nano‑F： 5’ ‑TCCAGACAGAGA ACCCGAA‑3’； SEQ ID NO.1； GPV‑Nano‑R： 5’ ‑GATGCTCATCATC CGTAAA‑3’； SEQ ID NO.2； GoAstV‑Nano‑F： 5’ ‑TTCAGACGC CCAGATAGAC ‑3’； SEQ ID NO.3； GoAstV‑Nano‑R： 5’ ‑TCACCAGGGTTAGAGTCGC ‑3’； SEQ ID NO.4； GPMV‑Nano‑F： 5’ ‑ACCGCCCAACACAGTCAC ‑3’； SEQ ID NO.5； GPMV‑Nano‑R： 5’ ‑CCATCAAGCATTGTCCCG‑3’； SEQ ID NO.6。 3.权利要求2所述的引物GPV ‑Nano‑F/R、 GoAstV ‑Nano‑F/R、 GPMV ‑Nano‑F/R在制备同时 检测GPV、 GoAst V和GPMV试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540545 A 2一种同时检测GPV、 GoA stV和GPMV的Na no‑PCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 更具体的说是涉及一种同时检测GPV、 GoAstV和 GPMV的Nan o‑PCR检测方法。 背景技术 [0002]鹅细小病毒病又称小鹅瘟， 是由鹅细小病毒(Goose  parvovirus， GPV)引起的一种 以渗出性肠炎为主要 特征的鹅的急性、 接触性传染病， 主要侵害20日龄以下的雏鹅， 传播速 度快， 发病率和致死率都较高。 鹅星状病毒病又称雏鹅痛风， 是一种由鹅星状病毒(Goose   astrovirus， GoAstV)引起的以严重关节痛风、 出血、 肾肿胀为主要特征的新型鹅病， 发病率 达80％， 死亡率高达50％； 经病毒的分离培养、 生物学特性和基因组分析， 确 定病原体为一 种新型鹅星状病毒。 鹅副黏病毒病又称鹅新城疫， 是一种由I型鹅副黏病毒(goose   paramyxovirus， GPMV)引起的以肠道糠麸样溃疡、 胰腺和脾脏肿大并有大小不一的灰白色 坏死灶为主要特征 的鹅的急性、 高度接触性传染病， 各个日龄的鹅均易感， 2周龄以内雏鹅 的发病率、 死 亡率均可达10 0％。 以上三种鹅病已严重影响我国养鹅业 健康发展。 [0003]目前用于检测上述三种病毒的方法包括病毒分离培养、 RT ‑PCR、 RT‑qPCR、 环介导 等温扩增(LAMP)和下一代测序等。 实时荧光定量PCR检测需要昂贵的仪器， LAMP检测容易被 污染。 [0004]因此， 提供一种同时检测GPV、 GoAstV和GPMV的Nano ‑PCR检测方法是本领域技术人 员亟需解决的问题。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了一种同时检测GPV、 GoAstV和GPMV的Nano ‑PCR检测方法， 灵敏度高、 特异性强。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]一种同时检测GPV、 GoAst V和GPMV的Nan o‑PCR检测方法， 具体步骤如下： [0008](1)样品预处 理， 获得cDNA； [0009](2)以步骤(1)获得的cDNA为模板， 利用引物GPV ‑Nano‑F/R、 GoAstV ‑Nano‑F/R、 GPMV‑Nano‑F/R进行Nan o‑PCR检测； [0010]所述Nano ‑PCR检测的反应体系为： 5U/μL  Taq enzyme Mix 0.4μL， 2 ×Nano‑ qPCRbuffer  12.5 μL， 模板3 μL， 三种病毒的上下游引物各1.25 μL， ddH2O 1.6 μL， 共25 μL； 所 述三种病毒的上下游引物终浓度均为0.5 μM； 反应条件为： 94℃预变性3min； 94℃变性30s， 50℃退火3 0s， 72℃延伸1mi n， 循环35次； 72℃延伸10mi n； [0011](3)对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。 [0012]进一步， 步骤(2)所述引物GPV ‑Nano‑F/R、 GoAstV ‑Nano‑F/R、 GPMV ‑Nano‑F/R的具 体序列如下： [0013]GPV‑Nano‑F： 5’ ‑TCCAGACAGAGA ACCCGAA‑3’； SEQ ID NO.1；说　明　书 1/5 页 3 CN 114540545 A 3