(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210093191.5 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 山东仕达思生物产业有限公司 地址 250013 山东省济南市历下区华能路 38号汇能大厦2 903 申请人 山东仕达思医疗科技有限公司 (72)发明人 谷立川　董宏杰　张俊梅　胡玮　 王明钰　何青　王峰　高翔　 谢晓鸿　谢时灵　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6893(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种超速 检测阴道毛滴虫的RT-PCR方法 (57)摘要 本发明涉及一种超快速检测阴道毛滴虫的 RT‑PCR方法， 包括通过针对阴道毛滴虫18S核糖 体RNA序列设计了一对特异性引物和探针PF1、 PR1、 FQQ， 以及通过采用荧光定量PCR反应对待测 样品核酸进行实时荧光定量PCR检测的反应程 序； 实时荧光定量逆转录PCR反应程序为： 3 7℃污 染消化2min； 95℃预变性30s； 95℃变性2s， 69℃ 退火延伸13s， 45个循环。 本发明引物、 探针使延 伸温度满足Taq  DNA聚合酶的最佳延伸温度， 从 而有效缩短扩增时间。 本发明的延长引物与模板 完全匹配， 且Tm值达到69℃左右， 可使退火延伸 同时在69℃开始进行， 从一开始就可以直接采用 两步法扩增， 减少升降温过程， 有效缩短检测时 间。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图5页 CN 114369648 A 2022.04.19 CN 114369648 A 1.一种超速检测阴道毛滴虫的RT ‑PCR方法， 其特征在于： 包括通过选择阴道毛滴虫18S 核糖体RNA序列， 设计一对特异性引物和探针PF1、 PR1和FQS， 以及通过采用荧光定量PCR反 应对待测样品核酸进行实时荧 光定量PCR检测的反应程序。 所述荧光定量PCR反应引物与探针PF1、 PR1和FQS的核苷酸序列分别为SEQ  ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2、 SEQ ID NO： 11； 所述实时荧 光定量逆转录PCR反应程序为： 37℃污染消化2mi n； 95℃预变性3 0s； 95℃变性2s， 69℃退火延伸13s， 45个 循环。 2.如权利 要求1所述的一种超速检测阴道毛滴虫的RT ‑PCR方法， 其特征在于： 荧光定量 PCR反应特异 性引物为延长引物， 所述延 长引物采用检测靶基因中的其中一段序列， 与基因 组模板完全互补配对。 3.如权利 要求2所述的一种超速检测阴道毛滴虫的RT ‑PCR方法， 其特征在于： 所述荧光 定量PCR反应探针为经过荧光标记的， 其5'端标记有荧光基团， 在距离5'端第11个碱基的T 碱基上标记有猝灭基团， 3'端通过Spacer  C3进行封闭。 4.如权利 要求3所述的一种超速检测阴道毛滴虫的RT ‑PCR方法， 其特征在于： 所述荧光 基团为Fam， 所述猝灭基团为BHQ1。 5.根据权利 要求4所述的一种超速检测阴道毛滴虫的RT ‑PCR方法， 其特征在于， 还包括 对内参基因HBB检测的引物对和探针； 所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷 酸序列如 SEQ ID NO:12～13所示； 所述针对内参基因HB B检测的探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:14所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369648 A 2一种超速检测阴道毛滴虫的RT ‑PCR方法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学检测技术及分子诊断领域， 特别涉及一种超速检测阴道毛 滴虫的RT ‑PCR方法。 背景技术 [0002]阴道炎又称为阴道炎症， 是导致外阴阴道症状如瘙痒、 灼痛、 刺激和异常流液的一 组病症。 阴道炎是女性生殖系统中最常见的感染性疾病之一。 根据流行病学调查显示， 总调 查总人数中有50％以上有生殖器的感染， 且阴道炎的感染在女性生殖系统传染病中居首 位， 病情严重发展 可导致宫颈炎， 盆腔 炎， 子宫内膜炎等。 更重要的是， 它会导致不孕、 流产、 感染胎儿等一系 列不良结果， 甚至进一步增加 患宫颈癌的风险。 在中 国， 好多女性一直收受 阴道炎的困扰， 治愈这种疾病时间长又易于反复感染。 常见 的临床阴道炎可分为细菌性阴 道炎、 滴虫性阴道炎、 念珠菌性阴道炎以及老年 性阴道炎 。 [0003]滴虫阴道炎是因为阴道毛滴虫降解细胞外基质以侵害患者生殖道的表皮而引起 的， 进而对白细胞浸润的炎症反应。 阴道毛滴虫作为一种兼性厌 氧性寄生虫， 仅有滋养体阶 段， 滋养体生活力较强， 能在3～5℃生存2日； 在46℃时生存20～60分钟； 在半干燥环 境中约 生存10小时； 在普通肥皂水中也能生存45～120分钟。 在ph5以下或7.5以上的环 境中则不生 长。 具有嗜血和嗜碱的特点。 它通过在上皮细胞中溶解和引导乳酸来诱导炎症， 传播途径主 要基于性传播。 它通常寄生在女性阴道和泌尿道中， 因此经常会引起女性阴道炎和尿道炎。 它也是HIV感染和宫颈癌诱 导的要危险因素。 [0004]目前， 滴虫性阴道炎的主要诊断手段有细胞培养法， 涂片染色法， 免疫荧光法。 细 胞培养法则实验时间长， 对实验条件要求高、 对标本采集要求严格、 费用相对较高。 涂片染 色法阳性率较低， 灵敏度不够。 免疫荧光法， 虽然灵敏度和特异性可以， 但需要培训专门的 工作者和需要有一台高质量的荧光显微镜。 这几种方法都需要显微镜来进行人工观察， 无 法进行批量检查。 当样本量大 的时候， 会造成工作人员视觉过度疲劳进而干扰结果的正确 性。 核酸检测技术广泛运用在临床感染性疾病的诊疗上， 其特异 性强、 灵敏度高和准确性得 到临床医生的信赖与支持。 [0005]RT‑qPCR作为一种高灵敏度、 高特异性的检测方法， 在临床多种病原体和病毒的检 测中发挥了重要作用。 为了缩短检测时间， 研究人员对RT ‑qPCR反应中的Taq  DNA聚合酶进 行了大量的改进工作， 如提高其反转录活性进行一步检测、 进行点突变和修饰以增大其延 伸速率， 然而到目前为止， Taq  DNA聚合酶的活性已经达到很高， 想要再通过提高Taq  DNA聚 合酶活性来缩短检测时间不太可行； 也有研究人员通过使用特殊仪器和更小的反应系统来 提高温度变化的速率， 如液滴数字PCR(ddP CR)， 但是这种方式降低了检测的稳定性和通量。 RT‑qPCR检测包括逆转录和PCR循环扩增两个过程， PCR循环扩增又包括变性、 退火和延伸三 个过程。 现有的核酸检测试剂盒都是将P CR循环扩增步骤中的退火和延伸合二为一， 采用两 步循环扩增来减少升温和降温的频率， 这就需要在引物的退火温度和Taq  DNA聚合酶的延 伸温度之间取一个平衡。 常规方法是将Taq  DNA聚合酶的退火延伸温度设置为探针的退火说　明　书 1/6 页 3 CN 114369648 A 3