(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210095125.1 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 四川大学 地址 610000 四川省成 都市一环路南 一段 24号 (72)发明人 邓锐杰　朱小颖　罗爱民　吴茗花　 (74)专利代理 机构 成都四合天行知识产权代理 有限公司 51274 代理人 董斌 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一对Wxc型糯高粱的ARMS-PCR引物及其分子 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一对Wxc 型糯高粱的ARMS ‑PCR 引物及其分子检测方法， 本发明属于糯高粱甄选 检测技术领域。 公开的引物Wxc ‑F、 Wxc‑R的核酸 序列分别如SEQ  ID NO： 1、 SEQ  ID NO： 2所示， Wxc 型糯高粱的ARMS ‑PCR分子检测方法， 包 括如下步 骤： (1)ARMS ‑PCR引物对 Wxc‑F、 Wxc‑R的设计； (2) 样品总DNA的提取， 利用S1的引 物进行ARMS ‑PCR 扩增反应； (3)采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增 产物， 根据凝胶成像系统上成像判定检测结果， 若有条带生成， 则表明该样品中含Wxc型糯高粱； 若无条带生成， 则表明该样品中不含Wxc型糯高 粱。 本发明不需要限制性内切酶进行切割， 且适 用于大量样品分析。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图3页 CN 114164259 A 2022.03.11 CN 114164259 A 1.一对Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR引物， 包括Wxc ‑F、 Wxc‑R， 其核酸序列分别如SEQ  ID  NO： 1、 SEQ ID NO： 2所示。 2.Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR分子检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)ARMS‑PCR引物对Wxc ‑F、 Wxc‑R的设计； (2)样品总DNA的提取， 利用S1的引物进行ARMS ‑PCR扩增反应； (3)采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物， 根据凝胶成像系统上成像判定检测结果， 若 有条带生成， 则表明该样品中含Wxc型糯高粱； 若 无条带生 成， 则表明该样品中不含Wxc型糯 高粱。 3.根据权利要求2所述的Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR分子检测方法， 其特征在于， 步骤(2) 中， 所述扩增反应的体系： 10μL  2×PCR Master， 1μL  DNA模板， 1μL  Wxc‑F， 1μL Wxc‑R， SterileddH2O补齐到20 μL。 4.根据权利 要求2或3所述的Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR分子检测方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述扩增反应的条件为： 94℃预变性3min， 之后进行32个循环的94℃30s、 50℃30s、 72℃30s， 最后进行 72℃终止延伸7mi n。 5.根据权利要求2所述的Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR分子检测方法， 其特征在于， 步骤(3) 中， 所述琼脂糖凝胶电泳判别的方法是： 取5μL的ARMS ‑PCR扩增产物， 加入1μL6 ×Loading  buffer， 混匀， 加入到3％的琼脂糖凝胶中， 于150V电压下电泳30min， 在凝胶成像系统上成 像观察结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114164259 A 2一对Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR引物及其分子检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于糯高粱甄选检测技术领域， 具体涉及一对Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR引 物及其分子检测方法。 背景技术 [0002]高粱为世界重要粮食作物之一， 与许多禾谷类作物一样， 其种子 的胚乳具有糯性 和粳性之分， 这是 由胚乳中直链淀粉和支链淀粉含量及比例决定的。 颗粒结合淀粉合成酶 (GBSS)是淀粉合 成途径中的关键酶， 它直接参与直链淀粉的生物 合成。 高粱糯性性状 分为4 种类型Wxa、 Wxb、 Wxc和Wxd。 Wxc是由GBSS基因第九内含子上有1个G缺失， 导致阅读 框的转变 和早期翻译终止 。 该缺失位于原核生物和真核生物高度保守的区域。 [0003]糯高粱是酿造白酒的主要原 料， 国酒茅台、 五粮液、 郎酒等名酒的酿酒工艺对高粱 有着特殊要求。 选育具有高乙醇转化率、 高产量、 高品质等优良籽粒性状的糯性高粱越来越 受到白酒行业的重视。 据有关文献报道， 我国西南地区白酒酿造用糯高粱主要为Wxa型和 Wxc型糯高粱。 [0004]过去糯高粱的鉴别方法主要为碘染色法、 双波长比色法等， 仪器简单、 操作方便， 但存在无法通量检测、 效率低的问题， 随着生物检测技术的发展， 生物检测技术也应用在了 糯高粱甄选上。 目前， 针对高粱糯性性状鉴别普遍采用普通PCR法和全基因组测序法。 ①普 通PCR法： 是一种在体外对 特定的DNA片段进行扩增的技术， 可以将少量的DNA片段进 行放大 扩增。 PCR技术的操作简 便， 只需将反应液和引物加入P CR仪中， 大部 分过程都能由仪器自动 完成， 扩增过程也较为迅速， 一般只需要3个小时左右即可完成扩增 。 不过， PCR反应产物需 要用限制性内切酶对产物进行酶切， 进行观察实验结果。 其反应耗材较多， 操作复杂。 ②全 基因组测序法： 全基因组测序包含糯高粱个体的核DNA的全部遗传信息， 与参考粳高粱基因 组比对可以获得非常全面的遗传标记信息， 如SNP等分子标记。 但 其成本高、 时间周期 长， 不 适用于大量样品分析， 因此很难在大多数检测部门推广使用。 [0005]ARMS‑PCR分子检测是比较好的方法， 专利申请号为2020111655981、 专利名称为 Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR引物及其分子检测方法的专利申请就公开了Wxc型糯高粱的ARMS ‑ PCR分子检测方法， 然而该申请虽然公开了Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR分子检测方法， 但是其 引物却并未公开， 使得该方法无法得以实现， 其它引物已无法应用于Wxc型糯高粱 的ARMS‑ PCR分子检测。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一对Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR引物及其分子检测方法， 以 解决现有酿 酒高粱检测技术存在成本高、 时间周期 长， 不适用于大量样品分析， 因此很难在 大多数检测部门推广使用的问题。 [0007]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0008]Wxc型糯高粱的ARMS ‑PCR引物， 包括Wxc ‑F、 Wxc‑R， 其核酸序列 分别如SEQ  ID NO：说　明　书 1/5 页 3 CN 114164259 A 3