(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210088031.1 (22)申请日 2022.01.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114107522 A (43)申请公布日 2022.03.01 (73)专利权人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市 市南区南海路7 号 (72)发明人 肖永双　马玉婷　李军　肖志忠　 吴燕铎　赵海霞　马道远　 (74)专利代理 机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 210 02 专利代理师 李颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 10913 6392 A,2019.01.04 CN 110607375 A,2019.12.24 CN 104789690 A,2015.07.2 2CN 109652523 A,2019.04.19 CN 102286479 A,201 1.12.21 Ming Li et al. .Reconstructi on of the Origin of a Neo- Y Sex Chromosome and Its Evolution in the Spot ted Knifejaw, Oplegnathus punctatus. 《Mo l. Biol. Evol.》 .2021,第38卷(第6期),第2615 -2626页. 薛蕊等.斑石鲷(Oplegnathus punctatus) 雌、 雄鱼核型及Ag-NORs带 型分析. 《海 洋与湖 沼》 .2016,第47 卷(第3期),第626 -632页. 李明等.斑石鲷基因 组学初步研究及性别特 异标记发掘与遗传性别鉴定技 术的建立. 《中国 博士学位 论文全文数据库 农业科技 辑》 .2021, (第3期),D0 52-2. Ming Li et al. .Isolation of a Male- Specific Mo lecular Marker and Devel opment of a Genetic Sex Identificati on Technique in Spotted Knifejaw(Oplegnathus punctatus). 《Mari ne Biotechnology》 .2020,第 1-8页. 审查员 唐亚丽 (54)发明名称 斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定 方法和试剂盒 (57)摘要 本发明涉及分子生物学技术对物种种质鉴 定的定性检测方法， 具体说是斑石鲷雌雄遗传性 别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒。 斑石鲷雌 鱼与雄鱼染色体的特异性标记的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1 （Xfm  ID Nm:1） 和SEQ  ID NO:2 （Ym  ID Nm:1） 所示碱基。 该方法利用一对引物在遗传 雄性个体中扩增出635bp和92 5bp两个相差29 0bp 的DNA片段， 在遗传雌性个体中仅扩增出635bp的 单一DNA片段， 并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨， 缩短了准确鉴定斑石鲷遗传性别的时间， 提升了 性别检测 效率。 在斑石鲷性别鉴定、 高雄苗种制备和家系选 育上具有重要的意 义和应用价 值。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114107522 B 2022.05.06 CN 114107522 B 1.一种斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记， 其特征在于， 斑石鲷雌鱼与雄鱼染色体的 特异性标记的核苷酸序列为SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2所示碱基。 2.按权利要求1所述的斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记， 其特征在于， 所述斑石鲷雌 鱼与雄鱼染色体的特异性标记SEQ  ID NO:1所示碱基为斑石鲷雌鱼X1染色体与斑石鲷雄鱼 异形染色体Y同源片段， 为斑石鲷雌、 雄遗传性别共有DNA特征标记； 且， 所述SEQ  ID NO:1所 示碱基序列第164位点和221位点之间插入序列片段， 即为SEQ  ID NO:2所示碱基序列， 其为 斑石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记。 3.一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的方法， 其特 征在于， （1） PCR扩增： 取待测斑石鲷， 提取基因组DNA； 以所得基因组DNA为模板， 采用斑石鲷遗 传性别特异 性引物对， 进行P CR扩增， 并将所得PCR扩增产 物与权利要求1所述的斑石鲷雌雄 遗传性别的特异性标记进行对比； （2） 结果判断： 从待测斑石鲷的基因组DNA中扩增出635bp和925bp两个DNA片段， 即为判 断该待测斑石鲷为斑石鲷遗传雄 性个体X1X2Y； 或， 待测斑石鲷的基因组DNA中仅扩增出635bp的单一DNA片段， 即为判断该待测斑石鲷 为斑石鲷遗传雌性X1X1X2X2。 4.按权利要求3所述的鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的方法， 其特征在于， 所述斑石鲷遗传 性别特异性引物对为： ChXY_F:1 : 5’ ‑AAACAGAGGACATTCAAGCCG‑3’； ChXY_R:2 : 5’ ‑GTTGCTGCCCTTCTTGCGT‑3’。 5.一种检测权利要求1所述的斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记的遗传性别特异性引 物， 其特征在于， ChXY_F:1 : 5’ ‑AAACAGAGGACATTCAAGCCG‑3’； ChXY_R:2 : 5’ ‑GTTGCTGCCCTTCTTGCGT‑3’。 6.一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒含权利要求5所述 的遗传性别特异性引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107522 B 2斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及鉴定方 法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术对物种种质鉴定的定性检测方法， 具体说是斑石鲷雌 雄遗传性别的特异性标记及鉴定方法和试剂盒。 背景技术 [0002]斑石鲷隶属于鲈形目（Perciformes）， 石鲷科（Oplegnathidae）， 石鲷属 （Oplegnathus ） ， 主要分布于西太平洋温热带海域， 喜栖息于10 ‑100m水深的岩礁、 砂砾、 贝 藻丛生的海区， 为恋礁性底栖鱼类； 幼鱼具有在夏、 秋季随着海藻漂移 生态习性。 肉食性， 齿 锐利， 可咬碎贝类或海胆等坚硬的外壳 （孟庆闻等， 1995） 。 斑石鲷皮下含有丰富的胶原蛋 白、 多种氨基酸及不饱和脂肪酸， 口感独特， 在日本料理中具有 “刺身绝品 ”之誉； 另外， 斑石 鲷体态优美， 鱼身光泽银 纹与黑褐色斑点结合， 被人们称之为 “梦幻之鱼 ”， 受垂钓爱好者及 消费者的青睐， 是一种具有较高食用和观 赏价值的海产鱼类 （高小强等， 2018） 。 目前人工繁 育的斑石鲷市场销售价格达到了200元/斤， 同时由于斑石鲷具有摄食贝壳食性特点， 可以 清理养殖网箱网衣， 节约了人力资源和网衣清理成本， 经济效益和生态效益极其显著。 斑石 鲷又是我国本 土自然种类， 其资源开发及可持续利用具长效性， 养殖 前景广阔。 [0003]斑石鲷雌鱼染色体核型为2n=48， 含有46条端着丝粒染色体和1对亚中部着丝粒染 色体， 遗传性别类型为 （X1X1X2X2） ； 雄鱼染色体核型为2n=47， 含有44条端着丝粒染色体和1 对亚中部着丝粒染色体以及1条巨大的异形染色体， 遗传性别类型为 （X1X2Y） （薛蕊等， 2016） 。 石鲷科鱼类在养殖过程中存在显著的雌雄生长二态性， 雄鱼生长速度快于雌鱼， 斑 石鲷高雄苗种和全雄苗种的制备将促进斑石鲷养殖产业的提质增效， 开展斑石鲷苗种遗传 性别快速鉴定技术的研发将有助于斑石鲷优良雄性种质的储备 （肖志忠， 2015） 。 由于斑石 鲷生殖周期较长 （3~4年） ， 在幼鱼和成鱼时期无法通过外部形态特征对斑石鲷性别进行准 确鉴定， 而在斑石鲷人工繁育和人工选育构建家系过程中都需要选择优质雌雄亲鱼 并实现 性别的精确鉴定， 因此， 建立斑石鲷雌、 雄遗传性别快速鉴定方法是实现斑石鲷高雄苗种制 备， 提升斑石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化 生产的重要手段。 [0004]目前已报道的斑石鲷雌、 雄遗传性别的鉴定采用的是 “三体法”即三条引物联合扩 增分析， 由于该方法采用的三条引物的退火温度不同， 造成目的条带扩增效率不一致、 扩增 产物不稳定； 同时该方法设计的遗传雄性个体特异性目的条带大小为222个碱基 （bp） ， 极易 同PCR扩增过程中的产生引物二聚体 （10~250bp） 混淆； 另外由于该方法中雄性个体另外两 条目的条带仅相差12个碱基 （bp） ， 导致在常规琼脂糖凝胶电泳上两条目的带的区分度差。 因此， 挖掘斑石鲷新的遗传性别特异分子标记， 建立斑石鲷雌雄遗传性别高效、 快捷鉴定的 分子技术成为斑石鲷人工 选育和养殖产业亟 待解决的技 术难题。 发明内容 [0005]本发明的目的在于一种斑石鲷雌雄遗传性别的特异性标记及其快速鉴定的方法。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用技 术方案为：说　明　书 1/5 页 3 CN 114107522 B 3