(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210093234.X (22)申请日 2022.01.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114182027 A (43)申请公布日 2022.03.15 (73)专利权人 宁波市产品食品质量检验研究院 （宁波市纤维检验所） 地址 315000 浙江省宁波市宁波高新区江 南路1588号D座 (72)发明人 邢家溧　承海　郑睿行　沈坚　 毛玲燕　徐晓蓉　姚振民　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 林娟(51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 105274099 A,2016.01.27 CN 106834520 A,2017.0 6.13 CN 10467390 0 A,2015.0 6.03 柳楠等.基于线粒体16S rRNA基因扩增检测 动物源性成分的方法研究. 《中国畜牧杂志》 .2016,(第15期), 审查员 王震 (54)发明名称 一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通 用筛检试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于熔解曲线技术的动 物源性成分通用筛检试剂盒及检测方法， 涉及分 子生物学检测技术领域。 本发明针对9种畜禽动 物基因组 中具有特定结构特征的基因片段， 设计 了通用型引物及分子信标荧光探针组合物。 以待 测样品的基因组DNA为模板， 应用本发明所公布 的试剂盒及方法进行实时荧光PCR检测及熔解曲 线分析， 通过比对受检样品熔解峰形状及对应的 特征熔解温度(Tm值)， 实现单管条件下对9种畜 禽动物源性成分的快速鉴定。 本发 明体系构成简 单、 应用成本低、 灵敏度高、 特异性强、 适用性好， 可用于食品、 饲料等样品中动物源性成分的快速 筛检和掺杂制假 鉴定。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 CN 114182027 B 2022.08.09 CN 114182027 B 1.一种快速鉴别动物源性成分的检测 组合物， 其特征在于， 包括通用引物和分子信标 探针； 所述通用引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示， 分子信标探针的核 苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述分子信标探针的5 ’端修饰有荧光报告基团， 探针的3 ’端 修饰有淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的检测组合物， 其特征在于， 所述报告基团选自但不限于FAM、 HEX、 JOE、 C Y3、 CY5， 所述淬灭基团选自但不限于DABC YL、 TAMRA、 BHQ。 3.一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒， 其特征在于， 含有权利要 求1或2所述的检测组合物。 4.根据权利要求3所述的动物源性成分通用筛检试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒中还 含有猪、 黄牛、 山羊、 驴、 马、 骆驼、 狗、 鸡和鸭的标准品。 5.根据权利要求4所述的动物源性成分通用筛检试剂 盒， 其特征在于， 所述标准品是以 猪、 黄牛、 山羊、 驴、 马、 骆驼、 狗、 鸡或鸭的基因组DNA为模板， 利用权利要求1或2所述的通用 引物扩增得到基因片段， 并将基因片段构建至载体上 形成重组质粒。 6.根据权利要求3~5任一项所述的动物源性成分通用筛检试剂 盒， 其特征在于， 包括反 应体系， 所述反应体系为以1  μL 待测样品的基因组DNA 提取液作为模板， 加入权利要求1或 2所述的检测组合物、 qPCR反应试剂、 ROX参比染料和超纯 水。 7.一种基于分子信标熔解曲线分析技术的动物源性成分快速筛检方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： （1） 提取待测样品的基因 组DNA； （2） 利用权利要求1或2所述检测组合物进行实时荧 光PCR扩增； （3） 熔解曲线分析； 所述方法用于非疾病诊断的目的； 所述检测方法的结果判定方法为： 9种畜禽动物基因扩增产物与分子信标形成的杂交 分子均具有特异的熔解温度， 在熔解曲线图上反映为具有该 Tm值的特征性熔解峰， 当受检 样品熔解峰对应的 Tm值与所述9种畜禽动物种属的特征 Tm值一致， 可直接获知受检样品对 应的动物种属； 当受检样品熔解峰对应的 Tm值与9种动物种属特征 Tm值均不匹配， 表明受检 样品可能含有2种及以上动物源性成分或样品来源为9种畜禽动物种属之外； 所述9种畜禽动物种属为猪、 黄牛、 山羊、 驴、 马、 骆驼、 狗、 鸡和鸭。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114182027 B 2一种基于熔解曲线技术的动物源性成分通用筛检试剂盒及检 测方法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种基于熔解曲线技术的动 物源性成分通用筛检试剂盒及检测方法， 属于分子生物学检测技 术领域。 背景技术 [0002]畜禽肉及其制品因风味鲜美、 营养丰富， 一直以来都是居民日常膳食构成中重要 的品类之一， 而其食品安全对保障消费者权益具有重要意义。 由于畜禽 肉及其制品的生产 成本高且市场消费需求大， 掺杂制假成为当前肉类食品存在的主要食品安全问题之一， 与 之相关的重大食品安全事件近年来在国内外屡有报道。 这类违法欺诈制销行为在给消费者 造成经济损失的同时， 其掺杂肉类原料 的不明来源也难以避免的造成一定的健康危害。 肉 类食品尤其是深加工产品在色、 香、 味、 形及口感等性状方面极为相 近， 难以用感官鉴定方 法对其成分来源进行直接区分， 这也成为食品质量安全检验检测 技术领域的一项难题。 探 索和研发 高效便捷、 灵敏特异、 成本合理的肉类食品源性 成分快速鉴定方法， 对于筑牢抵御 食品欺诈行为的技术防线， 有效防范行业性食品安全风险， 提高肉类食品安全监管和消费 保障能力具有重要的应用价 值和现实意 义。 [0003]当前， 关于食品、 饲料等样品中动物源性成分实验室鉴定方法的研究已有一定报 道， 在技术层面主要通过检测具有种属特异性的生物标志物(蛋白质或基因)， 从而达到鉴 定和区分样品种属 来源的目的。 相对于蛋白质检测技术而言， 基因鉴定因其靶分子具有更 好的稳定性、 多样性， 在同一个体中不存在组织间表达差异 性， 同时， 依靠P CR技术指数级扩 增效应可对微量样品进行准确检测， 灵敏度和特异性大幅度提升， 成为当前动物源性成分 鉴定方法中最常用的检测技术， 目前我国已颁布实施的食品安全标准中也建立了以动物特 异性基因为检测对象、 基于探针杂交技术或测序技术的标准检测方法。 但值得关注的是， 目 前常用的基因鉴别方法多采用 “一对一”检测模式， 即针对一种动物种属， 设计和使用一组 特异性引物和探针。 为达到多重鉴定目的， 往往需进行多次实验或采用多重引物及探针组 合物的检测方法， 工作量大、 体系组成复杂， 竞争干扰大， 鉴定成本高。 基因芯片技术虽具有 快速高效的多重检测能力， 但由于需要专 业设备和专用商品化试剂， 应用成本高， 在 食品检 验检测领域尚未广泛普及。 亦有已公开的检测技术采用通用型引物联合高分辨熔解曲线方 法实现多重鉴定目标， 但该类技 术对检测设备 具有特殊要求， 适用性较为局限。 [0004]分子信标是基于荧光共振能量转移原理设计的双标签寡核苷酸链探针， 通过独特 的茎‑环结构设计， 与靶基因杂交后， 可通过荧光检测实现对模板的定性鉴定及定量分析， 具有灵敏度高、 特异性好等优点。 同时， 由于其独特的构象设计， 可通过熔解曲线分析区分 杂交分子中基因错配情况， 因此， 也常被应用于基因突变的检测。 本发 明以动物基因组极为 广泛的异质性为应用基础， 基于 分子信标熔解曲线技术路线， 通过对9种常见畜禽动物线 粒 体基因组多重比对和特征筛选， 设计和应用一对通用引物及一根具有广泛错配分辨能力的 分子信标探针， 建立一种基于实时荧光P CR和熔解曲线分析技术、 适用于食品及饲料中常见说　明　书 1/8 页 3 CN 114182027 B 3