(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210093181.1 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 山东仕达思生物产业有限公司 地址 250013 山东省济南市历下区华能路 38号汇能大厦2 903 申请人 山东仕达思医疗科技有限公司 (72)发明人 谷立川　董宏杰　张俊梅　胡玮　 王明钰　何青　王峰　高翔　 谢晓鸿　谢时灵　 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、 探 针、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种缩短新型冠状病毒检测时 间的引物、 探针。 所述引物、 探针使延伸温度满足 Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度， 从而有效缩短 扩增时间。 另外， 改进后的long ‑ORF1ab降低了 PCR反应体系的背景荧光， 消除了探针过长导致 的猝灭效率降低的问题。 此外， 通过优化进一步 缩短了反转录和变性时间， 在不降低检测性能的 前提下， 将整个PCR检测时间从74min缩短到 37min。 本发明还涉及包含所述引物和探针的试 剂盒和使用所述引物和探 针进行检测的方法。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 CN 114214465 A 2022.03.22 CN 114214465 A 1.一种缩短新型冠状病 毒检测时间的引物、 探针， 其特征在于： 所述新型冠状病 毒引物 的碱基序列是SEQ  ID NO： 4和5， 探针的碱基序列是SEQ  ID NO： 7或SEQ  ID NO： 8。 2.如权利要求1所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、 探针， 其特征在于： 所 述引物两端延长， 且延长引物采用检测靶基因中的其中一段序列， 所述延长引物与基因组 模板完全互补配对。 3.如权利要求1所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、 探针， 其特征在于： 所 述探针为经过荧光标记的， 其5'端标记有荧光基团， 在距离5'端第6个碱基的T碱基上标记 有猝灭基团， 3'端通过Spacer  C3进行封闭。 4.如权利要求3所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、 探针， 其特征在于： 所 述荧光基团为Fam， 所述猝灭基团为BHQ1。 5.如权利要求1所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、 探针， 其特征在于： 所 述探针为经过荧光标记的， 其5'端标记有荧光基团， 在距离5'端第6个碱基的T碱基上标记 有第一猝灭基团， 3'端标记有第二猝灭基团。 6.如权利要求5所述的一种缩短新型冠状病毒检测时间的引物、 探针， 其特征在于： 所 述荧光基团为Fam， 所述第一猝灭基团和第二猝灭基团均为BHQ1。 7.一种缩短新型冠状病 毒检测时间的荧光PCR检测方法， 其特征在于： 所述方法包括以 权利要求 1‑6任一项所述的引物、 探针对待测样品RNA进 行实时荧光定量逆转录PCR检测， 产 生S型扩增曲线则为阳性。 8.如权利要求7所述的一种缩短新型冠状病 毒检测时间的荧光PCR检测方法， 其特征在 于： 所述实时荧 光定量逆转录PCR反应程序包括： 55℃反转录2mi n； 95℃预变性3 0s； 95℃变性2s， 70℃退火延伸13s， 45个 循环。 9.一种缩短新型冠状病 毒检测时间的检测试剂 盒， 其特征在于： 包括如权利要求1 ‑6任 一所述的引物、 探针。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114214465 A 2一种缩短 新型冠状病毒检测时间的引物、 探针、 试剂盒及检测 方法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学检测技术及分子诊断领域， 特别涉及一种缩短新型冠状病 毒检测时间的引物、 探针、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]由于在全球广泛接种SARS ‑CoV‑2疫苗需要相当长的时间， 因此对COVID ‑19感染人 群的快速诊断仍然是疫情防控的主要手段。 但是现有的检测技术仍难以满足检测需求， 特 别是在局部地区突发个例时， 需要对整个地区进行大规模筛查， 寻找潜在的感染者和密切 接触者， 这 就需要现有的检测技 术进一步完善， 缩短检测时间， 提高检测效率。 [0003]当前， 核酸检测和抗原检测是确诊COVID ‑19感染的两种主要方法。 根据技术原理， 核酸检测可分为两类:一类是靶向核酸扩增检测(TNAAT)， 主要包括荧光定量逆转录  PCR (RT‑qPCR)和等温扩增； 另一种是直接核酸检测， 无需靶向扩增， 如核酸杂交、 基因芯片等。 大量临床病例的调查数据显示， 至少35％的感染者属于无症状感染者。 这些无症状个体和 早期感染者的病毒载量较低， 靶向核酸的扩增检测无疑更有利于诊断。 虽然等温扩增已被 证明灵敏度高， 不需要精密的控温仪器， 前景非常广阔， 但大多 数等温扩增体系由多种酶和 引物组成， 反应体系复杂， 因此技术要求也较高。 与等 温扩增相比，  RT‑qPCR技术更加成熟， 且普及率较高。 医院和第三方检测机构均有成熟的PCR操作人员。 因此， RT ‑qPCR检测仍是现 阶段最流行的核酸检测技 术。 [0004]快速、 有效的病毒检测在新冠疫情时期格外重要， 它可以追踪密切接触者， 延长治 疗窗口， 支持靶向治疗。 由于SARS ‑CoV‑2的不断变异， 现有疫苗的实际保护期需要时间去证 明， 但在此之前， 我们需要不断改进现有的检测方法。 为了缩短检测时间， 研究人员对RT ‑ qPCR反应中的Taq  DNA聚合酶进行了大量的改进工作， 如提高其反转录活性进行一步检测、 进行点突变和修饰以增大其延伸速率， 然而到目前为止， Taq  DNA聚合酶的活性已经达到很 高， 想要再通过提高Taq  DNA聚合酶活性来缩短检测时间不太可行； 也有研究人员通过使用 特殊仪器和更小的反应系统来提高温度变化的速率， 如液滴数字PCR(ddPCR)， 但是这种方 式降低了检测的稳定性和通 量。 [0005]RT‑qPCR作为一种高灵敏度、 高特异性的检测方法， 在临床多种病原体和病毒的检 测中发挥了重要作用。 RT ‑qPCR检测包括逆转录和PCR循环扩增两个过程， PCR循环扩增又包 括变性、 退火和延伸三个过程。 现有的核酸检测试剂盒都是将P CR循环扩增步骤中的退火和 延伸合二为一， 采用两步循环扩增 来减少升温和降温的频率， 这就需要在引物的退火温度 和Taq DNA聚合酶的延伸温度之间取一个平衡。 常规方法是将Taq DNA聚合酶的退火延伸温 度设置为探针的退火温度－5℃(约60℃)， 但是现有这种方法存在以下缺点： Taq  DNA聚合 酶在工作过程中没有达到最高活性状态， 因此扩增速率未达到最高， 从而造成检测 耗时较 长。 因此， 开发一种使Taq  DNA聚合酶能够以更快的延伸速率工作， 同时不降低检测稳定性 和通量， 有效缩短新型 冠状病毒检测时间的一种引物、 探针、 试剂盒颇为重要。说　明　书 1/9 页 3 CN 114214465 A 3