(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210092953.X (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 复旦大学附属金山医院 （上海市金 山区眼病防治所、 上海市金山区核 化伤害应急救治中心） 地址 201508 上海市金山区龙航路15 08号 (72)发明人 陈刚　张聪　 (74)专利代理 机构 上海卓阳知识产权代理事务 所(普通合伙) 31262 代理人 周春洪 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/64(2006.01)C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 一种促进环状RNA 生成的反向互补短侧翼序 列及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种促进环状RNA生 成的反向互 补短侧翼序列及其应用。 本发明发现circE XOC6B 外显子的两侧近端的一对短的互补序列可以有 效促进cir cEXOC6B成环， 且对于cir cEXOC6B环化 是必要的， 而且将该序列连接到其他外显子两 侧， 仍然可以促进该外显子的环化， 提示该对短 序列对促进线性结构的外显子环 化具有普适性。 本发明证明了短反向互补序列同样能够高效的 促进环状RNA的环化， 揭示了环 状RNA成环的新机 制， 并有望降低人工合成环状RNA的成本 。 权利要求书1页 说明书5页 序列表11页 附图6页 CN 114350657 A 2022.04.15 CN 114350657 A 1.一种促进环状RNA成环的序列组合， 其特征在于， 所述促进环状RNA成环的序列组合 由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。 2.一种用于促进环状RNA成环的DNA框架， 其特征在于， 所述用于促进环状RNA成环的 DNA框架其结构为上游环 化驱动序列 ‑目的circRNA基因序列 ‑下游环化驱动序列， 所述上游 环化驱动序列如SEQ  ID NO:11所示， 所述下游 环化驱动序列如SEQ  ID NO:12所示。 3.一种基因表达盒， 其特征在于， 所述基因表达盒含有如权利要求2所述的用于促进环 状RNA成环的DNA框架或其互补序列。 4.一种促进环状RNA成环的载体， 其特征在于， 所述促进环状RNA成环的载体含有如权 利要求2所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架或其互补序列。 5.根据权利 要求4所述的促进环状RNA成环的载体， 其特征在于， 所述促进环状RNA成环 的载体其骨架载体为真核表达载体、 慢病毒载体、 腺病毒载体或腺相关病毒载体。 6.一种转基因细胞系， 其特征在于， 所述转基因细胞系通过转染权利要求4所述的促进 环状RNA成环的载体制备 得到。 7.权利要求4所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法， 其特征在于， 所述构建方法 包括将权利要求1所述的促进环状RNA成环的序列组合连入骨架载体的多克隆位点中的步 骤。 8.一种促进环状RNA成环并过表达的方法， 其特征在于， 所述促进环状RNA成环并过表 达的方法包括将权利要求2所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架连入骨架载体的多 克隆 位点中的步骤。 9.权利要求1所述的促进环状RNA成环的序列组合、 权利要求2所述的用于促进环状RNA 成环的DNA框架、 权利要求3所述的基因表达盒、 权利要求4所述的促进环状RNA成环的载体 或权利要求6所述的转基因细胞系在制备环状RNA过表达产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350657 A 2一种促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药技术领域， 具体地说， 涉及一种促进环状RNA生成的反向互补 短侧翼序列及其应用。 背景技术 [0002]环状RNA(circular  RNA， circRNA)是一种单链共价闭合的RNA分子， 由前体mRNA (pre‑mRNA)反向剪切而成。 1979年， 人类首次发现环状RNA的存在， 但起初其被认为是基因 剪切的副产物未给予足够重视。 随着 高通量测序技术和生物信息学 的发展， 目前在多种细 胞和物种中鉴定出了数以万计的环状RNA。 与线性RNA相比， circRNA具有较高的稳定性， 可 以从血液甚至尿液等其他体液中检出， 具有作为疾病发生、 发展的生物标志物的潜力。 尽管 目前研究普遍认为circRNA由对应的未成熟的pre ‑mRNA反向剪切而来， 至少通过RNA结合蛋 白或者环状RNA两侧内含子中长 反向互补序列， 二者中的一种促进成环， 但是目前针对这两 种以及其 他成环机制的研究仍 不够完善， 需要进一步探索和说明。 [0003]专利文献CN109943586A公开了一种植物circRNA过表达载体， 所述过表达载体包 括载体骨架， 目的circRNA基因及辅助成环序列， 所述辅助成环序列包括上游环 化序列和下 游环化序列， 所述上游环化驱动序列和所述下游环化驱动序列为一对内含子反向互补序 列； 所述辅助成环序列与目的circRNA基因形成以下结构： 上游环 化驱动序列 ‑目的circRNA 基因‑下游环化驱动序列。 但根据公开的序列可见该专利文献中反向互补的上游环化序列 和下游环 化序列为416b p， 即通过长反向互补序列促进pre ‑mRNA成环。 这与现阶段普遍认同 的circRNA的生成机制一 致， 即认为更多的互补序列更容 易配对形成环状结构。 [0004]总的来说， 现有技术并未公开短反向互补序列能够高效促进环状RNA环化的机制， 更未见有关本申请的促进环状RNA生成的反向互补短侧翼序列的报道。 发明内容 [0005]本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种促进环状RNA生成的反向互补 短侧翼序列及其应用。 [0006]第一方面， 本发明提供了一种促进环状RNA成环的序列组合， 所述促进环状RNA成 环的序列组合由SEQ  ID NO:11和SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成。 [0007]第二方面， 本发明提供了一种用于促进环状RNA成环的DNA框架， 所述用于促进环 状RNA成环的DNA框架其结构为上游环 化驱动序列 ‑目的circRNA基因序列 ‑下游环化驱动序 列， 所述上游环化驱动序列如SEQ  ID NO:11所示， 所述下游环化驱动序列如SEQ  ID NO:12 所示。 [0008]第三方面， 本发明提供了一种基因表达盒， 所述基因表达盒含有如上所述的用于 促进环状RNA成环的DNA框架或其互补序列。 [0009]第四方面， 本发明提供了一种促进环状RNA成环的载体， 所述促进环状RNA成环的 载体含有如上 所述的用于促进环状RNA成环的DNA框架或其互补序列。说　明　书 1/5 页 3 CN 114350657 A 3