(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210090655.7 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 山西农业大 学 地址 030801 山西省晋中市太 谷区铭贤南 路1号 (72)发明人 王德富　牛颜冰　张学治　杨智明　 贾彬良　崔丽艳　杜江　 (74)专利代理 机构 北京栈桥知识产权代理事务 所(普通合伙) 11670 代理人 潘卫锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种红花 花叶病病原检测与鉴定方法 (57)摘要 本发明涉及一种红花花叶病病原检测与鉴 定方法， 包括以下步骤： (1)扩增， 使用引物从红 花样品中获得重组酶聚合酶扩增(RPA)的扩增产 物； (2)分析RPA的扩增产物； (3)对分析完的扩增 结果进行结果判断， 出现相应的bp特征条带说明 所述红花样品感染了相应病毒； 未出现相应的bp 特征条带说明所述样品未感染花叶病毒。 本发明 能科学地、 有针对性地进行病原检测与鉴定， 快 速准确， 检测的稳定性好， 特异性强， 可为红花的 健康检测提供有效的监控手段， 确保生产安全， 还对其它病原的检测具有一定的参 考价值。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 114164306 A 2022.03.11 CN 114164306 A 1.一种红花 花叶病病原检测与鉴定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)扩增， 使用引物从红花样品中获得重组酶聚合酶扩增(RPA)的扩增产物； 所述引物 包括第一组引物和第二组引物， 第一组引物包括由SEQ  ID NO:1核苷酸序列组成的正 向引 物和由SEQ  ID NO:2核苷酸序列组成的反向引物； 第二组引物包括由SEQ  ID NO:3核苷 酸序 列组成的正向引物和由SEQ  ID NO:4核苷酸序列组成的反向引物； (2)分析RPA的扩增产物； (3)对分析完的扩增结果进行结果判断， 出现相应的bp特征条带说明所述红花样品感 染了相应病毒； 未 出现相应的bp特 征条带说明所述样品未感染花叶病毒。 2.根据权利要求1所述的红花花叶病病原检测与鉴定方法， 其特征在于， 所述第 一组引 物是用于检测黄瓜花叶病毒(CMV)的引物组， 所述第二组引物是用于检测豇豆蚜传花叶病 毒(CAMV)的引物组。 3.根据权利要求1所述的红花花叶病病原检测与鉴定方法， 其特征在于， 在所述步骤 (1)中， 以提取dsRNA为模板、 合成cDNA， 并由此以合成的cDNA为模板进行扩增， 并以健康红 花作阴性对照。 4.根据权利要求2所述的红花花叶病病原检测与鉴定方法， 其特征在于， 在所述步骤 (2)中， 将所得的RPA的扩增产物经电泳割胶回收纯化后， 以健康红花作为阴性对照， 以DL   1000Marker为标准分子量； 120V/90mA下电泳40 ‑45min， 用成像系统观察并拍照。 5.根据权利要求4所述的红花花叶病病原检测与鉴定方法， 其特征在于， 在所述步骤 (3)中， 确认RPA扩增产物中是否包 含657bp的657扩增产物。 6.根据权利要求4所述的红花花叶病病原检测与鉴定方法， 其特征在于， 在所述步骤 (3)中， 确认RPA扩增产物中是否包 含690bp的690扩增产物。 7.根据权利要求4所述的红花花叶病病原检测与鉴定方法， 其特征在于， 提取dsRNA的 步骤如下： a.分别取适量新鲜的疑似染病红花叶片， 置于研钵中， 用液氮研碎， 然后转入微型离心 管， 再加入适量提取液振荡混匀， 再加入适量的体积比为1:1的酚/氯仿， 保持反应条件为4 ℃， 6000r/min离心5mi n； b.取上清， 再加入等体积的上述 酚/氯仿， 4℃， 10 000r/min离心10mi n， 再重复2 ‑3次； c.取上清， 加入无 水乙醇使浓度为16.5％ 并混匀； d.称取1g  CF‑11， 置于微型离心管， 再加入3mL结合液， 振荡混匀； e.将含16.5％乙醇的上清液加入所述CF ‑11中， 涡旋混匀， 4800r/min离心5min， 再次涡 旋混匀， 4℃， 480 0r/min离心3mi n； f.弃上清， 加入3mL结合液涡旋混匀， 4℃， 480 0r/min离心3mi n； 弃上清重复2 ‑3次； g.弃上清， 加入3mL洗脱液涡旋混匀， 4℃， 4800r/min离心5min， 再次涡旋混匀， 4℃， 10000r/min离心5mi n； h.取上清， 加1/8洗脱液体积的3M  NaAc和3倍洗脱液体积的无水乙醇混匀， 在 ‑20℃沉 淀12h； i.4℃， 120 00r/min离心30min， 弃上清； j.加5mL 75％乙醇洗涤一次， 4℃， 120 00r/min离心30min弃上清； k.加300mL ddH2O溶解 沉淀， 保存在 ‑20℃。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114164306 A 2重复h‑j， 可增加dsRNA的纯度。 8.根据权利要求7所述的红花花叶病病原检测与鉴定方法， 其特征在于， 在所述步骤 (3)中， 确认RPA扩增产物中是否包 含690bp的扩增产物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114164306 A 3