(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210098153.9 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 中国水产科 学研究院黄海水产研究 所 地址 266000 山东省青岛市 市南区南京路 106号 (72)发明人 辛鲁生　于江南　白昌明　王崇明　 (74)专利代理 机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 陈娟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/543(2006.01)G01N 33/558(2006.01) (54)发明名称 鲍疱疹病毒HaHV -1通用型RPA核酸等温扩增 引物、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测技术领域， 具体 涉及一种鲍疱疹病毒HaHV ‑1通用型RPA核酸等温 扩增引物、 试剂盒及其应用。 所述引物为成套引 物组合， 由上下游引物和探针引物组成； 上游引 物如SEQ ID NO.1所示； 下游引物如SEQ  ID NO.2 所示； 探针引物如SEQ  ID NO.3所示。 本发明针对 目前已知鲍疱疹病毒HaHV ‑1不同变异 株， 根据保 守区段设计了通用的RPA扩增检测引物， 建立了 HaHV‑1的试纸条RPA检测体系和方法， 该技术对 养殖过程或进出口贸易中涉及HaHV ‑1的现场快 速筛查和检测具有重要价值， 市场应用前景广 阔。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 114107573 A 2022.03.01 CN 114107573 A 1.一种鲍疱疹病毒HaHV ‑1通用型RPA核酸等温扩增引物， 其特征在于， 所述引物为成套 扩增引物， 由上游引物、 下游引物和探针引物组成； 所述上游引物： 5’ ‑ACAAGGTCTTGTTTACTAAGATGTCTATG GCTC‑3’， 如SEQ ID NO .1所示； 所述下游引物： 5’ ‑biotin‑TACTTTCCTCAAGGAGGCCTTGCTCCTACCGT‑3’， 如SEQ ID NO .2所示； 所述探针引物： 5’ ‑ACAAGACCTGAACCATACTTTCGGTTAGATTGT ‑THF‑AGGTCCTTGTACGTA ‑SpC3‑3’， 如SEQ ID  NO .3所示。 其中， biotin表示生物素标记， FAM表示羧基荧光素标记， THF表示四氢呋喃连接子形成 缺刻， SpC 3表示Spacer  C3修饰。 2.一种含有如权利要求1所述的鲍疱疹病毒HaHV ‑1通用型RPA核酸等温扩增引物的试 剂盒。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述核酸扩增反应的体系为： 以25  μL 计， 具体为： 水化缓冲液15  μL， 280 mM醋酸镁1.2  μL， 10 μM上游引物和下游引物各 1.0 μL， 探针引物0.3  μL， 模板DNA  2.0 μL， 无核酸酶纯 水5.5 μL。 4.根据权利要求2或3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述核酸扩增反应的条件为： 37℃恒 温孵育30分钟。 5.一种如权利要求1所述的鲍疱疹病毒HaHV ‑1通用型RPA核酸等温扩增引物及权利要 求2‑4任一项所述的试剂盒在快速检测感染疱疹病毒HaHV ‑1的鲍鱼中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） 采用RPA试剂进行核酸恒温扩增反应； （2） 利用胶体金侧向流免疫层析 试纸条分析RPA扩增产物， 读取 试纸条结果。 7.根据权利 要求6所述的应用， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述核酸恒温扩增反应以25  μ l计， 具体为： 水化缓冲 液15 μl， 280 mM醋酸镁1.2  μl， 10 μM上游引物和下游引物各1.0  μ l， 探针引物0.3  μl， 模板DNA  2.0 μl， 无核酸酶纯 水5.5 μl， 37℃恒温孵 育30分钟。 8.根据权利 要求6或7所述的应用， 其特征在于， 步骤 （2） 具体过程为： 将RPA扩增产物用 超纯水稀释10倍， 随后加至胶体金侧向流免疫层析 试纸条加样端， 读取 试纸条结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107573 A 2鲍疱疹病毒HaHV ‑1通用型R PA核酸等温扩增引物、 试剂盒及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测技术领域， 具体涉及一种鲍疱疹病毒HaHV ‑1通用型 RPA核酸等温扩增引物、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]鲍病毒病、 鲍 裂壳病， 被我国 《一、 二、 三类动 物疫病病种名录》 列为三类动 物疫病， 《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》 列为二类进境动物疫病。 此类疫病严重威胁我国 南北鲍养殖。 1999年起， 我国南方地区， 以福建东山区为主， 出现了鲍疱疹病毒引起养殖鲍 的大规模死亡， 随后2003和2005年， 中国台湾地区养殖杂色鲍和澳大利亚的黑唇鲍 (Haliotis  rubra)、 绿唇鲍(Haliotis  laevigata)及其杂交种也出现了疱疹样病毒感染的 案例。 因当时对该病毒性疾病认知的有限性， 根据病鲍表现出的主要病理特征， 即腹足神经 节和中枢神经组织炎症和细胞浸润， 该病又被称为鲍病毒性神经炎  (Abalone  viral  ganglioneuritis,  AVG) 病毒。 后经基因组序列分析， 明确该病毒与OsHV ‑1的亲缘关系较 近， ICTV将该病毒命名为鲍疱疹病毒1  (Haliotid  herpesvirus  1, HaHV‑1)。 在随后的几 年之后中， 由于HaHV ‑1的潜伏期短， 发病急， 传染性强， 死亡率高， 造成鲍种苗及成鲍的大量 死亡， 4～30 d内死亡率高达95%以上。 我国杂色鲍养殖产业面临消亡的绝境。 在这样的背景 下， 加大对水产养殖动物疫病的监测工作从而将疫病扼杀在 摇篮之中就尤为重要。 [0003]目前针对HaHV ‑1的检测方法对仪器都有较强的依赖性， 对仪器操作人员有较 强的 背景理论知识要求， 主要包括电子显微镜观察法、 常规或荧光定量PCR等。 并且现有方法很 难满足一线养殖户在生 成过程中对疫病现场快速检测的需求。 研发适合用于HaHV ‑1现场诊 断的技术对于有效控制HaHV ‑1暴发流行 具有重要意 义。 [0004]多酶体系介导的核酸扩增技术(Recombinase  Polymerase  Amplification， RPA) 依赖DNA重组酶引导引物与目标片段序列结合， 替代了传统PCR依赖变温过程 实现引物与目 标片段的互补结合过程。 RPA恒温扩增最佳反应温度在37℃ ‑42℃， 反应速度快， 30分钟即可 获得可检出水平的扩增产物。 2017年， Gao等曾根据鲍疱疹病毒编码的ORF38设计了检测该 病毒的RPA实时荧光定量用引物、 探针。 针对RPA扩增产物的检测， 实时荧光RPA可对扩增反 应进程实时监控， 但需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器， 比如可控温酶标仪或荧光P CR 仪。 相比而言， 试纸条RPA对仪器 设备要求更低， 只需完成单温度控温扩增反应， 随后通过试 纸条层析读取试验 结果。 根据ORF38已设计的引物探针无法应用到试纸条PRA反应中， 因此， 设计适合于试纸条RPA反应的引物、 探针， 开展试纸条RPA检测更适合于应用到HaHV ‑1现场 检测。 发明内容 [0005]本发明的主要目的在于提供一种鲍疱疹病毒HaHV ‑1通用型RPA核酸等温扩增引 物， 该通用型RPA核酸 等温扩增引物能够实现 现场快速检测。说　明　书 1/5 页 3 CN 114107573 A 3