(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210102556.6 (22)申请日 2022.01.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114277154 A (43)申请公布日 2022.04.05 (73)专利权人 武汉康录生物技 术股份有限公司 地址 430075 湖北省武汉市武汉东湖新 技 术开发区高科园三路9号武汉光谷精 准医疗产业基地一期(全部自用)8号 厂房1-4层(1)厂房号 (72)发明人 魏照云　陈海燕　李雪梅　李倩　 (74)专利代理 机构 武汉世跃专利代理事务所 (普通合伙) 42273 专利代理师 邬丽明(51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 110964809 A,2020.04.07 CN 111254199 A,2020.0 6.09 CN 112094912 A,2020.12.18 审查员 陈小燕 (54)发明名称 一种用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的 检测试剂盒 (57)摘要 本发明属于分子诊断技术领域， 公开了一种 用于肺癌诊断和早期肺癌无创筛查的检测试剂 盒， 包括用于检测人源生物样品中肺癌相关基因 的靶区域的甲基化水平的引物对和荧光探针组 合， 所述肺癌相关基因为SHOX2、 RASSF1A、 PTGER4、 TAC1、 SOX17、 CDO1、 HOXA9 中的一种或多 种； 而且， 采用多个肺癌相关基因、 不同靶序列组 合检测能够有效提升检测的灵敏度、 特异性和准 确性。 该试剂盒采用甲基化特异性荧光定量PCR 的方法， 操作简单， 易于推广， 对于提升肺癌患者 生存率具有重要意义， 具备良好的临床应用前 景。 权利要求书2页 说明书13页 序列表8页 附图5页 CN 114277154 B 2022.11.29 CN 114277154 B 1.一种用于检测人源生物样品中肺癌相关基因的靶区域的甲基化水平的引物对和荧 光探针组合物在制备辅助诊断肺癌检测试剂盒中的应用， 其特 征在于， 所述引物对和荧光探针组合物用于对亚硫酸盐处理后的肺癌相关基因的靶区域进行 荧光定量PCR扩增； 所述肺癌相关基因为SHOX2、 PTGER4和TAC1； 所述SHOX2基因的靶区域为GRCh38:3:158096298 ‑158096648  和GRCh38:3:158098932 ‑ 158099255； 所述PTGER4基因的靶区域为GRCh38:5:40679693 ‑40679952  和GRCh38:5:40681355 ‑ 40681679； 所述TAC1基因的靶区域为GRCh38:7:97732108 ‑97732308  和GRCh38:7:97732777 ‑ 97732976； 其中， 用于扩增所述SHOX2基因的靶区域的引物对和荧光探针组合物为组合1和组合2， 所述组合1的引物对序列如SEQ  ID No.1~2所示， 所述组合1的荧光探针序列如SEQ  ID No.3 所示， 所述组合2的引物对序列如SEQ  ID No.4~5所示， 所述组合2的荧光探针序列如SEQ  ID  No.6所示； 用于扩增所述PTGER4基因的靶区域的引物对和荧光探针组合物为组合5和组合6， 所述 组合5的引物对序列如SEQ  ID No.13~14所示， 所述组合5的荧光探针序列如SEQ  ID No.15 所示， 所述组合6的引物对序列如SEQ  ID No.16~17所示， 所述组合6的荧光探针序列如SEQ   ID No.18所示； 用于扩增所述TAC1基因的靶区域的引物对和荧光探针组合物为组合7和组合8， 所述组 合7的引物对序列如SEQ  ID No.19~20所示， 所述组合7的荧光探针序列如SEQ  ID No.21所 示， 所述组合8的引物对序列如SEQ  ID No.22~23所示， 所述组合8的荧光探针序列如SEQ  ID  No.24所示； 所述检测试剂盒还包括用于扩增所述人源生物样品中经亚硫酸盐处理后的ACTB基因 保守序列的ACTB引物对和荧 光探针组合物； 所述ACTB引物对和荧光探针组合物中的引物对序列如SEQ  ID No.43~44所示， 且其荧 光探针序列如SEQ  ID No.45所示； 所述人源生物样品为血清或血浆。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述荧光探针的5 ’端标记有荧光报告基 团， 所述荧光探针的3 ’端标记有荧 光淬灭基团； 所述荧光报告基团为FAM、 ROX、 VIC、 JOE、 CY3、 CY5、 NED、 TAMRA和TEXAS  RED中的任意一 种； 所述荧光淬灭基团为AMRA、 DABC YL、 ECLIPSE、 BHQ‑1、 BHQ‑2、 BHQ‑3和MGB中的任意 一种。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述检测试剂 盒包括对人源生物样品进行 DNA提取和纯化的试剂； 所述提取和纯化的试剂包含将所述人源生物样品DNA中未甲基化的 胞嘧啶转 化为尿嘧啶的亚硫酸盐转 化剂。 4.权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述亚硫酸盐转化剂为亚硫酸氢钠、 亚硫酸氢 铵、 偏重亚硫酸钠中的一种或两种以上。 5.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述检测试剂 盒包括阴性质控 品和阳性质权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114277154 B 2控品， 所述阴性质控品为纯化水、 检测靶区域甲基化阴性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的 bisDNA或人工合成的检测靶区域甲基化阴性的质粒中的任意 一种； 所述阳性质控品为检测靶区域序列甲基化阳性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的bisDNA 或人工合成的检测靶甲基化阳性的质粒中的任意 一种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114277154 B 3