(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210098037.7 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 珠海贝索细胞科学技术有限公司 地址 519000 广东省珠海市香洲区同昌路 286号2栋第四层 (72)发明人 张健　孔伟圣　陈智妍　吴宇曼　 (74)专利代理 机构 北京圣州专利代理事务所 (普通合伙) 11818 代理人 黄青青 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) (54)发明名称 一种检测支 原体的LAMP引物和试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种检测支原体的LAMP引物 和试剂盒， 属于基因工程技术领域， 所述LAMP引 物包括内引物、 外引物和环引物， 引物的核苷酸 序列依次如SEQ  ID No1～5所示。 采用本发明提 供的LAMP引物50min得到检测结果， 灵敏度达到 10‑2ng/ul。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图5页 CN 114410753 A 2022.04.29 CN 114410753 A 1.一种检测支原体的LAMP引物， 其特征在于， 所述LAMP引物包括内引物、 外引物和环引 物； 所述内引物包括1 ‑FIP和1‑BIP， 所述1 ‑FIP的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述1 ‑ BIP的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示； 所述外引物包括1 ‑F3和1‑B3， 所述1 ‑F3的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示， 所述1 ‑B3的 核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示； 所述环引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示。 2.根据权利要求1所述的LAMP引物， 其特征在于， 所述支原体包括猪鼻支原体、 发酵支 原体、 精氨 酸支原体、 人型支原体、 口腔支原体、 唾液支原体、 梨支原体、 无胆甾支原体、 无乳 支原体、 牛支 原体、 上颌支 原体、 关节炎支 原体和肺 支原体中的一种或多种。 3.根据权利要求1所述的LAMP引物， 其特征在于， 所述LAMP引物检测支原体时， 反应的 条件包括： 反应温度为62mi n， 反应时间为5 0min。 4.根据权利要求1所述的LAMP引物， 其特征在于， 所述述LAMP引物检测支原体时， 反应 的体系包括： 2.5ul  10×ThermoPol  Buffer、 1.5ul  100mM的MgSO4、 3.5ul浓度为10mM的 dNTP、 4ul  1‑FIP、 4ul  1‑BIP、 0.5ul  1‑F3、 0.5ul  1‑B3、 2ul环引物、 1ul  Bst DNA  Polymerase Large Fragment、 1.5ul羟基萘酚蓝溶 液、 2ul模板DNA和2ul超纯 水。 5.根据权利要求4所述的LAMP引物， 其特征在于， 所述反应的体系中1 ‑FIP和1‑BIP的终 浓度分别为1.6uM， 所述1 ‑F3和1‑B3的终浓度分别为0.2uM， 所述环引物的终浓度为0.8uM 。 6.根据权利要求4所述的LAMP引物， 其特征在于， 所述羟基萘酚蓝溶液的终浓度为 12mM。 7.根据权利要求4所述的LAMP引物， 其特征在于， 所述MgSO4的终浓度为6mM， 所述Bst   DNA Polymerase Large Fragment的终浓度为320U/ml， 所述dNTP  Mix的终浓度为1.4 mM， 所 述模板DNA的终浓度为1ng/ul。 8.根据权利要求1所述的LAMP引物， 其特征在于， 使用 LAMP引物扩增后的产物为淡蓝 色， 扩增出20 0～250bp的条带， 结果为阳性。 9.一种检测支原体的试剂盒， 其特征在于， 包括： 权利要求1所述的LAMP引物、 羟基萘酚 蓝溶液、 MgSO4、 Bst DNA Polymerase Large Fragment、 dNTP  Mix和阳性对照。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述阳性对照包括人 型支原体。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410753 A 2一种检测支原体的LAMP引物和试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于基因工程 技术领域， 尤其涉及一种检测支 原体的LAMP引物和试剂盒。 背景技术 [0002]动物细胞 的培养， 支原体污染是个严重的问题。 支原体(mycoplasma)是细胞外生 存的最小微生物。 是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物， 大小一般在0.3 ‑0.5um之间， 呈 高度多形性， 有球形、 杆形、 丝状、 分枝状等多种形态。 它不同于细胞， 也不同于病毒。 种类繁 多、 分布广泛、 造成的危害相当大， 涉及人、 动物、 植物及昆虫等多个领域， 给人类健康和科 研工作带来不利影响。 细胞培养过程中容易污染的支原体主要 是猪鼻支原体、 发酵支原体、 精氨酸支原体、 人型支原体、 口腔支原体、 唾液支原体、 梨支原体、 无胆甾支原体等， 约占污 染细胞的支 原体99％左右。 [0003]支原体缺乏细胞壁， 对青霉素类抗生素不敏感， 但有具有革兰氏阳性细菌 的部分 特点， 因而对链霉素敏感性也十 分有限。 支原体在人工培养过程中， 培养液除了pH发生变化 外， 基本上能保持澄清透明， 只在培养后 期活菌滴度达到峰值时才会 出现轻度混浊。 这些特 点也为支原体污染细胞和病毒培养物而不容被发现提供了良好支持。 在细胞培养和病毒的 细胞繁殖中， 最为常见的污染就是支原体污染， 细胞培养液中常用加入双抗(青霉素和链霉 素)抑制细菌 污染， 但对支 原体的作用十分有限。 [0004]目前支原体检测方法主要包括微生物培养、 生化检测、 ELISA、 直接或间接荧光染 色、 免疫荧光和核酸扩增技术[直接或巢式聚合酶链反应(PCR)]。 不幸的是， 常规的诊断程 序通常很耗时(即需要几个星期才能得到结果)， 需要高水平的技术技能和专家人员。 因此， 需要快速和敏感的检测方法来评估假定被污染的细胞培养物。 在这方面， 基于分子生物学 方法开发的较新的测试系统， 特别是PCR， 可以在4.5 ‑24小时内得到结果， 被细胞培养实验 室普遍采用。 然而， P CR和电泳过程所需的复杂程序和相对昂贵的机器限制了其使用。 因此， 开发简单、 敏感、 特异、 快速和低成本的检测方法是至关重要的。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种检测支原体的LAMP引物和 试剂盒， 采用本 发明提供的LAMP引物5 0min得到检测结果， 灵敏度达 到10‑2ng/ul。 [0006]为了实现上述发明目的， 本发明提供了以下技 术方案： [0007]本发明提供了一种检测支原体的LAMP引物， 所述LAMP引物包括内引物、 外引物和 环引物； [0008]所述内引物包括1 ‑FIP和1‑BIP， 所述1 ‑FIP的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所 述1‑BIP的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示； [0009]所述外引物包括 1‑F3和1‑B3， 所述1 ‑F3的核苷酸序列如S EQ ID No.3所示， 所述 1‑ B3的核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示； [0010]所述环引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示。说　明　书 1/7 页 3 CN 114410753 A 3