(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210098660.2 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 天津喜诺生物医药有限公司 地址 300450 天津市滨 海新区滨 海旅游区 滨海产业园二区2-1,2,3 -101 申请人 天津一瑞生物科技股份有限公司 　 一瑞 （苏州） 医药有限公司 (72)发明人 夏斌　董恒　陈晓玲　李可可　 王思怡　苑庆华　何永胜　 (74)专利代理 机构 天津诺德知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 12213 代理人 栾志超　王旭 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12Q 1/04(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因 的LAMP引物组及应用 (57)摘要 本发明公开用 于检测革兰氏阴性杆菌碳青 霉烯酶基因的LA MP引物组及应用， LA MP引物组包 括两条外引物， 两条内引物和两条环引物， 序列 如SEQ ID NO.1‑6所示。 本发明所设计的LAMP引 物组能够用于扩增68种KPC亚型， 可检测范围广 泛， 最低检测限可达到10  CFU/μL； 能够用于肺 炎克雷伯菌等革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶 基因的鉴定， 具有灵敏度高、 特异性强， 操作简单 便捷等优点。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图6页 CN 114107534 A 2022.03.01 CN 114107534 A 1.用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的LAMP引物组， 其特征在于： 包括两条外 引物， 两条内引物和两条环引物； 外引物F3序列如SEQ  ID NO.1所示， 外引物B3序列如SEQ  ID NO.2所示； 内引物FIP序列如SEQ  ID NO.3所示， 内引物BIP序列如SEQ  ID NO.4所示； 环引物LoopF序列如SEQ  ID NO.5所示， 环引物L oopB序列如SEQ  ID NO.6所示。 2.用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂 盒， 其特征在于： 包括权利要求1所 述的LAMP引物组。 3.根据权利要求2所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒， 其特征 在于： 还包括指示剂， 指示剂为 荧光指示剂或混合染料显色剂。 4.根据权利要求3所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒， 其特征 在于： 所述 荧光指示剂为SYBR  Green i或Calcei n； 或者， 所述混合染料显色剂为钙黄绿素染料和羟基萘酚蓝染料的混合物。 5.根据权利要求4所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒， 其特征 在于： 混合染料显色剂包括试剂A和试剂B， 试剂A和试剂B体积比为1:1 ‑2； 试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰， 钙黄绿素的浓度为5 00 μM， 氯化锰浓度为10mM； 试剂B中含有羟基萘酚蓝， 羟基萘酚蓝浓度为0.32mM 。 6.根据权利要求2 ‑5中任一所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂 盒， 其特征在于： 还 包括缓冲液、 DNA  Bst聚合酶、 阳性对照和阴性对照。 7.根据权利要求6所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒， 其特征 在于： 缓冲液为10 ×反应缓冲液， 包 括： 200mM Tris‑HCl， 100mM  (NH4)2SO4， 600mM KCl， 25mM  MgSO4和1%Tween 20。 8.根据权利要求6所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒， 其特征 在于： 阳性对照为KPC基因阳性的DNA模板， 序列如SEQ  ID NO.7所示； 阴性对照为灭菌双蒸 水。 9.权利要求1所述用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因 的LAMP引物 组或权利要求 2‑8中任一所述的用于检测革兰氏阴性杆菌碳青霉烯酶基因的试剂盒在检测革兰氏阴性杆 菌常见碳青 霉烯酶基因中的应用。 10.根据权利要求9所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用， 其特 征在于： 检测肺炎克 雷伯菌中碳青 霉烯酶基因。 11.根据权利要求9所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用， 其特 征在于： 指示剂为荧光指示剂， 荧光定量P CR后通过荧光曲线 形状判定待测样品中是否含有 碳青霉烯酶基因。 12.根据权利要求11所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用， 其 特征在于： 若荧光指示剂为SYB R Green i， 当荧光曲线出现S型曲线， 则判断待测样品中含 有碳青霉烯酶基因； 或者， 若荧光指示剂为Calcein， 当荧光曲线出现V型曲线， 则判断待测样品中含有碳青 霉烯酶基因。 13.根据权利要求9所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用， 其特 征在于： 指示剂为混合染料显 色剂， 比对LAMP扩增反应前后反应体系颜色， 判断待测样本中权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114107534 A 2是否含有碳青 霉烯酶基因。 14.根据权利要求13所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用， 其 特征在于： LAMP扩增前， 反应 体系呈灰蓝色； LAMP扩增结束后， 阳性反应液为天蓝色， 阴性反应也 为紫罗兰色。 15.根据权利要求14所述的在检测革兰氏阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因中的应用， 其 特征在于： 反应 体系至于透明载体中， 反应结束后直接通过 载体透明外壁观测体系颜色。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114107534 A 3