(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210098940.3 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 广州生凌医疗科技有限公司 地址 510000 广东省广州市增城区新塘镇 民营大道西7号 （厂房B2） 自编6号 (72)发明人 陈伟珊　孙江山　吴纯阳　 (74)专利代理 机构 南昌逸辰知识产权代理事务 所(普通合伙) 36145 代理人 刘林艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种四种肠道病毒的核酸检测试剂盒、 引物 探针组及检测方法 (57)摘要 本发明提出了一种四种肠道病毒的核酸检 测试剂盒、 引物探针组及检测方法， 属于基因工 程技术领域， 肠道病毒EV 的上游引物为序列EV ‑ F1、 EV‑F2； 下游引物为序列EV ‑R， 特异性探针为 序列EV‑P， EV71的上游引物为序列EV71 ‑F； 下游 引物为序列EV71 ‑R， 特异性探针为序列EV71 ‑P， CA16的上游引物为序列CA16 ‑F； 下游引物为序列 CA16‑R， 特异性探针为序列CA16 ‑P， CA6的上游引 物为序列CA6 ‑F； 下游引 物为序列CA6 ‑R， 特异性 探针为序列CA6 ‑P1、 CA6‑P2， 本发明的检测试剂 盒通过一步法荧光定量PCR进行检测， 操作 简便， 可快速读取 结果。 权利要求书2页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 114410842 A 2022.04.29 CN 114410842 A 1.肠道病毒EV、 EV71、 CA16、 CA6的引物探针组， 其特 征在于： 其中， EV的上游引物为序列 EV‑F1、 EV‑F2； 下游引物为序列 EV‑R， 特异性探针为序列EV ‑ P， 其中上游引物的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:2所示； 下游引物的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:3所示； 特异性探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； EV71的上游引物为序列EV71 ‑F； 下游引物为序列 EV71‑R， 特异性探针为序列 EV71‑P， 其 中上游引物的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:5所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6 所示； 特异性探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示； CA16的上游引物为序列CA16 ‑F； 下游引物为序列 CA16‑R， 特异性探针为序列 CA16‑P， 其 中上游引物的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:8所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:9 所示； 特异性探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:10所示； CA6的上游引物为序列CA6 ‑F； 下游引物为序列CA6 ‑R， 特异性探针为序列CA6 ‑P1、 CA6‑ P2， 其中上游引物 的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:11所示； 下游引物 的核苷酸序列如SEQ   ID NO:12所示； 特异性探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:13、 SEQ  ID NO:14所示。 2.肠道病毒EV、 EV71、 CA16、 CA6的四重核酸检测试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒包括如 权利要求1所述的引物探针组。 3.根据权利要求2所述的肠道病毒EV、 EV71、 CA16、 CA6的四重核酸检测试剂盒， 其特征 在于， 所述肠道病毒EV的特异性探针序列的5 ’端用ROX修饰， 3 ’端用BHQ2修饰； 所述EV71的 特异性探针序列的5 ’端用CY5修饰， 3 ’端用BHQ2修饰； 所述CA16的特异性探针序列9的5 ’端 用JOE修饰， 3 ’端用BHQ1修饰； 所述CA6的特异性探针序列的5 ’端用FAM修饰， 3 ’端用BHQ1修 饰。 4.根据权利要求2所述的肠道病毒EV、 EV71、 CA16、 CA6的四重核酸检测试剂盒， 其特征 在于， 由荧光P CR检测反应液、 权利要求1所述的引物探针组混合液、 酶混合液、 阳性对照品、 阴性对照品组成。 5.根据权利要求4所述的肠道病毒EV、 EV71、 CA16、 CA6的四重核酸检测试剂盒， 其特征 在于， 成分如下 所示： (1)RT‑PCR反应液： 包括 荧光PCR缓冲液、 dNTP、 DEPC水； (2)引物探针混合液： 包括权利要求1所述的引物探针组； (3)混合酶液： 包括RNA酶抑制剂、 逆转录酶、 DNA聚合酶； (4)阳性对照： 包括含权利要求1所述引物探针组的扩增目的片段的EV、 EV71、 CA16、 CA6 源性RNA； (5)阴性对照： 为TE溶 液。 6.根据权利要求2所述的肠道病毒EV、 EV71、 CA16、 CA6的四重核酸检测试剂盒， 其特征 在于， 所述试剂盒于 ‑20℃避光储 存。 7.根据权利要求2所述的肠道病毒EV、 EV71、 CA16、 CA6的四重核酸检测试剂盒， 其特征 在于， 其中正向引物、 反向引物、 特异性 荧光探针的摩尔比为： EV： 200： 200： 160； EV71： 400： 200： 600； CA16： 200： 300： 600； CA6： 200： 200： 60： 60。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114410842 A 28.一种四重荧 光PCR方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.提取待测样本的总RNA； S2.以所述总RNA为模板， 并使用权利 要求1所述的引物探针组， 进行重组酶聚合酶扩增 反应； S3.收集FAM、 JOE、 C Y5、 ROX检测通道荧 光信号， 得到检测结果： S301.质控标准： 阳性对照的FAM、 JOE、 CY5、 ROX荧光信号有荧光指 数增长， 且Ct值≤30； 阴性对照和空白对照无荧 光指数增长， Ct值≥40； S302.阳性样品： 当步骤S301成立时， FAM或/和JOE或/和CY5或/和ROX有荧光指 数增长， 且Ct值≤ 37， 表明该样品检出CA6或/和CA16型或/和EV71型或/和肠道病毒通用； S303.阴性样品： 当步骤S301成立时， FAM或/和JOE或/和CY5或/和ROX无荧光指 数增长， Ct值≥40， 表明该样品未检出CA6或/和CA16型或/和EV71型或/和肠道病毒通用； S304.疑似样品： 当步骤S301成立时， FAM或/和JOE或/和CY5或/和ROX有荧光指 数增长， 且37≤Ct值≤40， 重复检测一次； 如复检结果仍在37≤Ct值≤40， 有明显指数增长， 则判定 为阳性， 否则为阴性。 9.根据权利要求8所述的四重荧 光PCR方法， 其特 征在于， 反应液配制如下表1所示： 表1 。 10.根据权利要求8所述的四重荧 光PCR方法， 其特 征在于， 反应条件如下表 2所示： 表2 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114410842 A 3